Cupriavidus necator H16中两种蛋白质生产遗传系统的比较

《Bioresource Technology》：Comparison of two genetic systems for protein production in Cupriavidus necator H16

　　

密码子使用调整对于提高C. necator中的蛋白质产量至关重要。核糖体结合位点（RBS）调整影响了启动子泄漏表达和最大表达。T7 RNA聚合酶（T7RNAP）激活显著降低了最终OD₆₀₀。C. necator生产了148 mg/L纯化的烯还原酶YqjM，与E. coli相当。C. necator生产了比E. coli BL21(DE3)更多的黄素单核苷酸（FMN）负载酶。

生物催化利用酶的高选择性和高效性，是传统化学合成的绿色替代方案。大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)及其T7 RNA聚合酶（T7RNAP）系统是原核蛋白生产的金标准，但高密度培养存在有机酸积累、蛋白酶解和包涵体形成等问题，且部分异源蛋白因缺乏合适的伴侣蛋白或成熟因子而难以正确折叠。因此，探索非模式细菌作为替代宿主具有重要意义。Cupriavidus necator（C. necator）是一种兼性化能自养菌，能够利用H₂、O₂和CO₂自养生长，也能利用甲酸，且蛋白含量高，并具有欧洲食品安全局（EFSA）的QPS资格。然而，该菌株中高效重组蛋白生产系统仍不成熟，已有T7系统依赖专有菌株，近期在H16上的尝试未能超越阿拉伯糖诱导的PBAD启动子系统。本研究旨在系统建立并优化C. necator中的T7RNAP表达系统，并与已有的pMVRha质粒系统进行比较。

研究人员将受L-鼠李糖或水杨酸盐诱导的T7RNAP整合至C. necator基因组，利用绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因，通过逐步迭代工程发现密码子使用是限制蛋白产量的主要瓶颈。通过密码子优化和密码子协调，结合核糖体结合位点（RBS）强度与T7启动子变体的系统筛选，构建了优化菌株C. necator T7R2。随后，以FMN依赖的烯还原酶YqjM为目标酶，比较了T7R2/pT7α2-yqjM与pMVRha-yqjM两种系统，并以E. coli BL21(DE3)/pET28a-yqjM为参照。结果显示，C. necator虽总可溶性蛋白产量低于E. coli，但FMN负载量和比酶活显著更高，证明其在生产含辅因子酶方面的优势。该研究为C. necator作为蛋白质生产底盘提供了标准化遗传工具，并拓展了C1基生物催化的可能性。

本研究样本包括C. necator H16衍生菌株（如ΔRM、ΔnagR、T7R、T7S、T7R2、T7RT）及E. coli BL21(DE3)。主要技术方法包括：基于Golden Gate的模块化克隆组装质粒；电穿孔法进行基因组整合或质粒转化；荧光分光光度法测定GFP突变体3（GFPmut3）表达量；Ni-NTA亲和层析纯化His标签YqjM；分光光度法测定FMN在452 nm/445 nm的吸收以定量辅因子负载；SDS-PAGE分析可溶性蛋白；基于NADPH消耗的酶活测定。所有实验至少设置生物学重复。

3.1 T7 RNA聚合酶在C. necator H16中受两个诱导型启动子控制表达：通过基因组整合和GFP报告，发现L-鼠李糖诱导在10 mM时达最高表达，但最大荧光与pMVRha相似；水杨酸盐高浓度抑制生长，故弃用该启动子。

3.2 C. necator含有比E. coli更多的稀有密码子：通过计算基因组密码子频率和密码子适应指数（CAI），发现C. necator具有23个稀有密码子（频率低于10%），而E. coli仅6个，表明tRNA池可能不足，导致翻译瓶颈。

3.3 密码子使用是C. necator高产蛋白的限制因素：通过比较密码子优化前后的GFP基因，发现优化可使荧光提高4倍，证明密码子使用是限制翻译效率的关键因素。

3.4 新设计的T7表达菌株降低了系统泄漏表达：构建T7R2（弱RBS+密码子协调T7RNAP）和T7RT（含自剪接内含子核糖开关SIBR），T7R2泄漏表达减半且维持最大产量；T7RT虽紧密但诱导后产量低。

3.5 优化表达质粒中的遗传部件可进一步改进系统：测试新T7启动子变体和合成RBS，发现变体可降低泄漏且保持产量；增强RBS仅增加泄漏，提示存在其他瓶颈。

3.6 烯还原酶YqjM能在C. necator中高产：在不同诱导OD、温度和密码子版本下，密码子协调显著提高产量；T7R2系统每单位生物量产生的FMN最高，但最终OD₆₀₀较低。

3.7 C. necator在YqjM辅因子负载上更高效：纯化后比较，E. coli获得最高蛋白产量（158 mg/L），但FMN负载仅为3.2 nmol/mg蛋白；C. necator T7R2和ΔRM分别为16.7和11.5 nmol/mg蛋白，且比酶活分别高1.6倍和1.4倍。

讨论部分指出，T7RNAP激活导致最终细胞密度显著下降，可能是代谢负担所致，这限制了体积产率；pMVRha因高生物量而总产量更高。E. coli BL21(DE3)仍是蛋白纯化的首选，因为可通过补充FMN弥补辅因子缺失。然而，C. necator的辅因子负载效率更高，适合全细胞催化，且可消除外源FMN添加成本。本研究结果对FMN依赖酶尤为重要，但可能不适用于其他蛋白类别。优化表达系统将有助于在化能自养或甲酸利用条件下实现CO₂驱动的酶合成。

结论：总之，研究人员开发并表征了两种在非模式细菌C. necator中生产蛋白质的遗传系统。本研究的T7系统在每单位生物量上产生更多FMN结合的YqjM，但最终生物量低。先前开发的表达质粒pMVRha因生长末期达到更高细胞密度而实现更高的总FMN结合YqjM产量。这些系统可用于生产在E. coli中难以表达的酶，如因包涵体形成或缺乏辅因子成熟伴侣而难以表达的酶。尽管E. coli BL21产生更多可溶性酶，但C. necator的一个菌株在产生FMN结合的活性酶方面优于E. coli，突显了C. necator在某些全细胞应用中的潜力。此外，这些优化表达系统可用于化能自养或甲酸利用条件下的酶生产，最终实现CO₂驱动的酶合成。