低强度脉冲超声（LIPUS）激活脑膜淋巴管内皮细胞Piezo1机械敏感通道经YAP–HIF-1α–VEGFC轴重建创伤性脑损伤小鼠脑淋巴引流功能

《Brain Stimulation》：Low-intensity pulsed ultrasound activates Piezo1 to restore brain lymphatic drainage and improve outcomes in traumatic brain injury mice

　　

背景 脑膜淋巴管（meningeal lymphatic vessels, mLVs）是引流脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）并介导中枢神经系统免疫监视的特化淋巴结构。创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）后该引流系统受损，mLVs发生结构退化，CSF向外周淋巴组织的流出显著减慢，由此导致的过度磷酸化tau、淀粉样蛋白-β（amyloid-β, Aβ）及炎症介质蓄积驱动持续性神经炎症与认知功能衰退。低强度脉冲超声（low-intensity pulsed ultrasound, LIPUS）在TBI小鼠中的神经保护作用此前已被证实，然而其对脑淋巴引流的影响尚不明确。方法 研究人员采用控制性皮层撞击（controlled cortical impact, CCI）TBI小鼠模型并结合连续LIPUS刺激，探究其对mLVs功能的治疗潜力。结果 LIPUS恢复了TBI小鼠的神经功能，改善运动协调性与空间/识别记忆，同时减轻tau病理、Aβ负荷及星形胶质细胞反应性。机制上，LIPUS激活脑膜淋巴管内皮细胞（lymphatic endothelial cells, LECs）上的Piezo1，触发下游信号级联，在体外促进LEC增殖与迁移，在体内恢复淋巴管覆盖度与引流功能。为明确该过程的关键介导因子，研究人员检测了通路的下游组分，发现血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor C, VEGFC）是关键下游效应分子：VEGFC过表达可挽救脑膜淋巴管重建与CSF引流。结论 上述结果确立LIPUS作为一种无创治疗策略，可在功能上恢复TBI后的脑淋巴引流，是一种具有前景的临床前治疗策略，适用于蛋白病相关神经系统疾病，值得进一步优化以推动临床转化。

**一、研究背景与科学问题**

创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）是全球致死与致残的主要原因之一，据2021年全球疾病负担研究估计，每年新增病例约2084万例。除急性期死亡外，TBI还带来沉重的长期负担：即使轻型TBI患者中亦有15%–30%出现持续性脑震荡后症状，包括认知缺陷、头痛与睡眠障碍，损害功能独立性与生活质量；中重度TBI预后更差，多数存活者存在认知损害，尤以处理速度、记忆与执行功能为著。TBI现已被确认为神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）与慢性创伤性脑病（chronic traumatic encephalopathy, CTE））的既定危险因素，痴呆风险随损伤严重程度与频次呈剂量-反应式增加。以神经炎症、血脑屏障破坏及跨突触传播的tau过度磷酸化为特征的急性病理级联驱动这一进行性神经退行，然而尚无药物干预被证实能改变病程，TBI目前缺乏可改善早期结局或减轻迟发性神经退行的循证治疗。

脑膜淋巴管（meningeal lymphatic vessels, mLVs）的重新发现革新了对脑内环境维持机制的认识。这些位于硬脑膜内、沿硬脑膜窦分布的特化淋巴通道是脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）、大分子与免疫细胞流向深部颈淋巴结（deep cervical lymph nodes, Dclns）的主要流出途径，其存在挑战了中枢神经系统免疫豁免的传统教条，建立了脑与外周之间的物理通道。新近证据显示TBI破坏该引流基础设施：mLVs结构退化、CSF流出减慢，毒性蛋白与炎症介质蓄积放大神经损伤。然而，受损淋巴网络如何重建以恢复脑内废物清除，仍为未解决的基本问题。

Piezo1是mLVs发育与功能维持的关键机械感受器。在颅缝早闭小鼠中，用Yoda1药理学激活Piezo1可恢复受损的脑膜淋巴结构、增加CSF引流、减轻脑水肿并降低颅内压。低强度脉冲超声（low-intensity pulsed ultrasound, LIPUS）作为一种无创物理手段，可有效穿透完整颅骨并向颅内结构传递机械能。研究人员据此假设：若LIPUS能激活脑膜淋巴内皮上的Piezo1，则可能恢复TBI小鼠的淋巴引流功能。尽管LIPUS在TBI后发挥神经保护的证据充分，但其能否直接调控脑淋巴引流系统以促进废物清除这一关键问题仍未解决；机械刺激恢复TBI后受损淋巴结构的分子机制完全未被探索；Piezo1虽被认定为维持淋巴管完整性的关键机械感受器，LIPUS能否激活脑膜淋巴内皮Piezo1以启动修复与功能恢复亦属未知。本研究据此对TBI模型小鼠实施LIPUS，评价其对神经功能与脑淋巴引流的影响。

**二、主要关键技术方法**

研究采用成年雄性C57BL/6小鼠（8周龄，北京维通利华实验动物技术有限公司）与Lyve1-IRES-iCre小鼠（品系号T004985，GemPharmatech，南京），全部动物程序经天津医科大学及天津医科大学总医院动物伦理委员会批准并遵循ARRIVE指南。关键技术包括：（1）控制性皮层撞击TBI模型结合连续LIPUS刺激（体内1 MHz、0.8 W/cm² ISPPA、50%占空比、100 Hz脉冲重复频率、每日15 min；体外0.3 W/cm²、10%占空比）；（2）行为学评价体系，含改良神经功能缺损评分、转棒、Y迷宫、新物体识别（novel object recognition, NOR）与Morris水迷宫；（3）多路径示踪剂清除检测，经枕大池（intra-cisterna magna, i.c.m.）注射RITC-右旋糖酐或荧光微珠评价CSF淋巴引流，经纹状体注射评价间质溶质清除，并以Aβ42-488示踪病理蛋白清除；（4）Lyve1-IRES-iCre小鼠经i.c.m.递送AAV实现淋巴管内皮细胞（lymphatic endothelial cells, LECs）特异性Piezo1、YAP敲低及VEGFC过表达，联合依霉素（echinomycin）药理学抑制HIF-1α；（5）体外原代人LECs结合GsMTx4抑制、钙成像、划痕愈合、Western blot、免疫共沉淀、CHX追踪与泛素化分析，以及蛋白质组学与生物信息学富集分析。

**三、研究结果**

LIPUS改善TBI后神经与认知缺陷。安全性评价显示14天LIPUS治疗后脑与头皮H&E染色无明显病理改变。TBI后5 min起始、连续14天LIPUS治疗使转棒跌落延迟与mNSS评分改善，自第1天显现并持续至第14天；Y迷宫自发交替率、NOR辨别指数及MWM空间学习记忆损害均被减轻，而旷场试验中央区探索时间在各组间无差异。结果确立LIPUS改善TBI后神经与认知损害。

LIPUS减轻TBI后tau病理与星形胶质细胞活化。伤后3 d取材的免疫荧光、ELISA与Western blot显示，TBI小鼠海马CA1、齿状回及周围皮层p-tau（Ser404）沉积与GFAP阳性星形胶质细胞显著扩增，tau在Thr205、Ser404、Ser396位点过度磷酸化且总tau（Tau5）蓄积，LIPUS逆转上述异常并降低脑内Aβ水平，提示LIPUS为伤后tau病变与星形胶质增生的有效抑制因素。

LIPUS促进TBI后mLVs重建并改善CSF流出与间质清除。全脑膜铺片显示TBI后LYVE1阳性脑膜淋巴管稀疏、破碎、覆盖减少，LIPUS增加淋巴管覆盖与管径，并提高Ki67⁺LYVE1⁺面积比。TBI后VE-cadherin、VEGFR3、PROX1、LYVE1及成熟调控因子FOXC2与促淋巴管生成因子VEGFC表达下降，LIPUS恢复上述蛋白表达。双示踪策略显示TBI后i.c.m.示踪剂在mLVs与Dclns蓄积减少、纹状体注射示踪剂脑实质滞留增加，LIPUS均予改善；Aβ42-488示踪进一步表明LIPUS减少脑实质滞留并增加Dcln蓄积，即改善病理蛋白的间质与淋巴清除。

Piezo1介导LIPUS诱导的mLVs与引流功能恢复。经i.c.m.注射AAV-CMV-DIO-sh-Piezo1构建LEC特异性Piezo1敲低小鼠（Pz1kdLEC），流式证实Piezo1阳性LEC由约80%降至约40%；LIPUS在对照小鼠引起脑膜LEC内钙显著升高，该反应在Pz1kdLEC小鼠明显减弱。无LIPUS时Piezo1敲低对淋巴覆盖与Dcln引流无明显影响；而在LIPUS治疗的TBI小鼠中，Piezo1敲低消除治疗引起的淋巴覆盖、CSF淋巴引流、间质溶质清除与LEC增殖增益，并部分抵消Aβ42-488清除改善，增加脑内病理蛋白水平；同时Piezo1敲低废除LIPUS对转棒、MWM与NOR的改善，行为学与病理学结果一致。

LIPUS激活Piezo1驱动LEC增殖与迁移。原代人LECs经LIPUS（1 MHz、0.3 W/cm² ISPPA、10% DC、100 Hz PRF、每日15 min）处理后15 min内Fluo-4 AM标记的细胞内钙急剧升高，Piezo1选择性抑制剂GsMTx4（5 μM）可将其消除；72 h Ki67免疫荧光显示LIPUS使增殖LEC比例近乎倍增；划痕试验中LIPUS处理组8 h迁移加快、24 h接近完全愈合，GsMTx4阻断该反应。结果提示LIPUS经Piezo1触发钙信号、增殖与迁移的协同程序，构成淋巴管重建的细胞学基础。

HIF-1α–VEGFC轴驱动LIPUS诱导的LEC增殖与迁移。对LIPUS处理人LECs的蛋白质组学分析（FC > 1.5或< 0.67，P < 0.05）检出3207个差异蛋白（上调2325、下调882），上调蛋白的GO与KEGG富集显著集中于VEGF与HIF-1信号通路。Western blot与ELISA证实LIPUS升高HIF-1α与VEGFC蛋白水平，GsMTx4逆转之，提示通道激活位于HIF-1α稳定与VEGFC上调之上游。LIPUS上调VEGFR3并增加AKT与ERK1/2磷酸化，GsMTx4减弱上述反应；中和性抗VEGFC抗体共处理废除LIPUS引起的Ki67⁺比例增加与划痕闭合加速。结果确立LIPUS经Piezo1启动HIF-1α–VEGFC–VEGFR3轴协调LEC增殖与迁移。

LIPUS经Piezo1–YAP轴稳定HIF-1α以驱动VEGFC表达。RT-qPCR显示HIF-1α mRNA无变化，提示翻译后调控；CHX追踪证实LIPUS显著减缓HIF-1α蛋白降解，GsMTx4部分逆转；MG132阻断下的免疫共沉淀显示LIPUS强力抑制HIF-1α多聚泛素化，GsMTx4部分逆转。MG132处理LECs中免疫共沉淀证实YAP与HIF-1α存在内源性相互作用；LIPUS降低YAP磷酸化并促其核蓄积，GsMTx4部分拮抗。siRNA敲低YAP后HIF-1α泛素化恢复、半衰期缩短、蛋白水平下降并伴VEGFC分泌减少。体内经i.c.m.注射AAV-CMV-DIO-sh-YAP构建YAPkdLEC小鼠，流式证实YAP阳性LEC由约80%降至约20%，该小鼠脑膜淋巴覆盖减少、mLVs热点与Dclns荧光微珠蓄积下降。研究总结LIPUS经Piezo1促YAP去磷酸化与核转位，核内YAP结合HIF-1α阻断其泛素-蛋白酶体降解，该YAP–HIF-1α轴促进VEGFC表达并在体内得到验证。

VEGFC过表达在HIF-1α抑制下仍恢复引流功能。经i.c.m.注射AAV-DIO-VEGFC构建条件性VEGFC过表达Lyve1-IRES-iCre小鼠并同时给予HIF-1α抑制剂依霉素。ELISA显示依霉素显著抑制LIPUS诱导的VEGFC表达，而携带VEGFC转基因小鼠在HIF-1α抑制下蛋白水平仍获恢复；依霉素减少LYVE1阳性淋巴管覆盖，VEGFC过表达部分逆转。依霉素损害LIPUS对CSF淋巴引流、间质溶质清除与荧光微珠淋巴流出的改善，VEGFC过表达逆转各项缺陷；依霉素降低Ki67⁺脑膜淋巴管比例，VEGFC过表达挽救之；依霉素增加脑实质Aβ42-488滞留并减少Dcln信号，VEGFC过表达在HIF-1α阻断下逆转上述效应；依霉素所致运动协调、神经功能评分及空间与识别记忆损害亦被VEGFC过表达逆转。结果确立VEGFC为LIPUS–Piezo1–HIF-1α轴的关键下游效应分子。

**四、讨论与结论**

讨论指出，本研究确立LIPUS经Piezo1–YAP–HIF-1α–VEGFC机械转导级联在TBI后功能性恢复mLV结构与CSF引流，从而改善神经功能缺陷、减轻tau病理并恢复认知功能，揭示了物理机械力调控中枢神经系统淋巴引流的前所未知机制。作者将本研究结果与既往LIPUS在TBI中促进BDNF、GDNF与VEGF表达、减轻脑水肿与血脑屏障破坏、抑制小胶质细胞介导的神经毒性及星形胶质细胞过度活化等多效性神经保护证据相联系，认为LIPUS的神经保护源于神经炎症抑制、代谢废物清除与神经营养支持的协同汇聚。讨论强调TBI后脑膜淋巴引流的结构与功能损害是病理级联中关键而此前被低估的节点，脑膜淋巴与类淋巴系统功能障碍汇聚形成代谢废物蓄积与持续神经炎症的恶性循环；并比较了经TRPV4–AQP4通路促进类淋巴流入的极低强度超声与本研究经淋巴内皮Piezo1启动转录程序的作用差异，提出联合增强类淋巴流入与恢复脑膜淋巴流出的协同策略构想。作者还讨论了Piezo1作为机械感受器在淋巴瓣膜形成、神经发生、认知功能及经颅磁声刺激中的多重作用，并指出YAP–HIF-1α–VEGFC轴的发现为理解机械力如何编排淋巴管重建提供了新理论框架；同时提及LIPUS可能经改善淋巴引流与减轻神经炎症间接恢复神经网络连接，需在慢性TBI范式中进一步研究。局限性包括：结论源于小鼠模型与体外原代人LECs，未用人原代脑膜淋巴内皮细胞或离体人脑膜组织验证，存在物种差异；主要聚焦急性期（伤后3 d）与短期行为学结局（至第20天），慢性期修复持久性未知；仅纳入雄性小鼠存在性别偏倚；未排除TRPV4、TRPC1或整合素介导机械转导等平行通路及Wnt/β-catenin、Notch信号交互；小鼠与人颅骨声学特性差异、长期经颅超声安全参数空间未定及治疗窗狭窄构成临床转化障碍。作者据此提出慢性TBI模型评价、人源验证、参数优化、多模态成像、性别比较与联合治疗等后续方案。

结论部分译文：总之，本研究系统阐明了LIPUS经Piezo1–YAP–HIF-1α–VEGFC机械转导级联恢复TBI后mLV引流功能的分子机制。这些发现不仅为机械信号如何调控中枢神经系统淋巴引流提供了基础理论见解，也为探索TBI及相关神经退行性疾病的非侵入性干预途径奠定了机制基础。鉴于LIPUS在神经保护、抗炎、促进神经营养因子及调控脑功能连接方面的既有优势，结合超声介导类淋巴清除的最新进展，LIPUS是值得继续开展机制研究与转化开发的有前景候选策略。