基于截短型HER2与HSV-TK的双开关安全系统实现T细胞免疫治疗的安全可控性与高效富集

《STAR Protocols》：A dual-switch safety system enables safety controllability and high-efficiency enrichment for T cell immunotherapy

　　

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已在相当比例的B细胞恶性肿瘤患者中实现了持久且完全的缓解。然而，在CAR-T细胞治疗过程中，不良事件的发生——包括针对健康组织的靶向/脱肿瘤毒性、细胞因子释放综合征（CRS）、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS），以及由病毒载体随机基因组整合引发的T细胞恶性肿瘤风险——严重威胁着患者安全。在本研究中，研究人员开发了一种新型截短型HER2（tHER2）-单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSVTK）双开关安全系统，并利用Cas12a/腺相关病毒（AAV）递送平台将其定点整合至PDCD1基因座。重要的是，该双开关系统能够实现基于磁珠的对tHER2-HSVTK（tHER2-TK）阳性T细胞的高效富集，允许通过赫赛汀或小分子药物更昔洛韦（GCV）对工程化T细胞的存续进行可调性调控，并在输注前提供一种高效的纯化方法。总之，这些特性在不影响治疗效果的前提下增强了安全性，促进了更安全、更可控的工程化T细胞免疫疗法的发展。

研究背景与科学问题

过继性T细胞疗法（ACT），包括工程化T细胞受体（TCR）和嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法，在癌症治疗中展现出显著的临床潜力。自2017年首个CAR-T产品获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准以来，已有七种CAR-T疗法被授权用于商业化治疗白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。然而，CAR-T细胞带来的显著治疗获益伴随着不容忽视的安全性隐患。2023年11月，FDA发布安全通报，指出接受自体CAR-T细胞免疫治疗的患者中出现了包括CAR阳性淋巴瘤在内的T细胞恶性肿瘤病例。尽管后续真实世界研究表明此类恶性肿瘤的发生率仅为0.03%，四年累积发生率为0.6%，但病毒载体介导的转基因随机基因组整合所固有的致瘤潜能仍是一个重大关切，该过程可能导致T细胞增殖失控甚至继发性血液系统恶性肿瘤。此外，CAR-T疗法还可能诱发严重的、危及生命的不良反应，如细胞因子释放综合征（CRS）、移植物抗宿主病（GVHD）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。高活性工程化T细胞的持续存在也可能导致靶向/脱肿瘤（OTOT）效应，损害健康组织。因此，迫切需要提高T细胞免疫疗法的可控性和安全性。现有策略如诱导型caspase-9（iCasp9）和单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSVTK）系统可通过小分子激活剂选择性清除工程化细胞，而CD20和表皮生长因子受体（EGFR）等表面标志物可作为利妥昔单抗或西妥昔单抗介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）的靶点。然而，针对T细胞表达的表面标志物的抗体药物本身可能诱导OTOT毒性。为此，研究人员旨在开发一种更为安全、可控的新型安全开关系统。

研究内容与结论

本研究开发了一种由截短型人表皮生长因子受体2（tHER2）与单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSVTK）融合而成的双开关安全系统（tHER2-TK），并将其与FMC63-scFv为基础的TCR样CAR（STAR）或传统第二代CAR共表达于T细胞中。该系统利用CRISPR-Cas12a/腺相关病毒血清型6（rAAV6）递送平台，将tHER2-TK表达盒定点整合至原代人T细胞的PDCD1基因座。研究证实，该双开关系统具备三重功能：首先，tHER2作为细胞表面标志物，可被抗HER2单克隆抗体偶联的磁珠高效识别和富集，实现约90%纯度的工程化T细胞分选；其次，tHER2可通过与赫赛汀结合，招募自然杀伤（NK）细胞介导强效的ADCC效应，在体外低效应靶比（NK:T=1:5）及低浓度赫赛汀（100 ng/mL）条件下24小时内即可清除约80%的tHER2阳性T细胞，在小鼠体内模型中，单次注射赫赛汀后16小时即观察到外周血中HER2阳性T细胞的大幅消除；第三，HSVTK组分可被小分子药物更昔洛韦（GCV）激活，通过抑制DNA复制实现较慢速但持久的细胞清除，在体外5-7天内达到近100%的清除效率，在异种移植小鼠模型中，多次GCV给药也能有效清除两种不同架构的CAR-T细胞（FMC63-28ζCAR和FMC63-STAR），从而解除其抗肿瘤活性。重要的是，该安全开关的整合并未损害CAR-T细胞自身的效应功能，其在体外和体内的肿瘤杀伤能力与常规CAR-T细胞相当。

关键技术方法

1. 1.
   CRISPR-Cas12a/rAAV6介导的定点基因整合技术：设计靶向PDCD1基因第二外显子5'端的CRISPR RNA（crRNA），通过电穿孔将Cas12a核糖核蛋白（RNP）复合物导入原代人T细胞，随后以感染复数（MOI）为5×10⁵的rAAV6供体模板转导，实现tHER2或tHER2-TK表达盒在PDCD1基因座的位点特异性敲入，同时破坏PD-1表达以减少T细胞耗竭。对于共表达体系，还同时靶向TRAC基因座以整合STAR或CAR构建体。
2. 2.
   基于ADCC的快速清除机制评估：从健康供者外周血单个核细胞（PBMCs）中分离原代NK细胞，与tHER2阳性T细胞按不同比例（NK:T = 1:2至1:20）共培养，加入不同浓度赫赛汀（50-1000 ng/mL），通过流式细胞术在不同时间点（8-96小时）检测tHER2阳性T细胞的存活比例，以评估抗体依赖的快速清除动力学。
3. 3.
   基于HSVTK/GCV的慢速清除机制评估：将tHER2-TK阳性T细胞暴露于不同浓度更昔洛韦（GCV，1-25 μg/mL），通过细胞活力测定在连续时间点（1-7天）监测细胞死亡情况，以评估小分子药物介导的、依赖于DNA复制的渐进式清除效果。
4. 4.
   抗HER2抗体偶联磁珠的细胞富集技术：生产并纯化源自曲妥珠单抗的抗HER2单克隆抗体（mAb），通过化学交联法将该抗体偶联至纳米磁珠上，用于对tHER2-TK阳性CAR-T或STAR-T细胞进行免疫磁性分选，并以荧光激活细胞分选（FACS）作为阳性对照评估分选纯度。
5. 5.
   异种移植小鼠模型验证：使用NCG免疫缺陷小鼠（NOD/ShiLtJGpt-Prkdc^em26Cd52Il2rg^em26Cd22/Gpt），通过尾静脉注射CD19阳性的Raji-luc淋巴瘤细胞建立肿瘤模型，随后输注工程化T细胞，并通过生物发光成像监测肿瘤进展，通过流式细胞术分析外周血中T细胞的药代动力学，以评估安全开关在体内的功能。

研究结果详述

1. 将截短型HER2靶向整合至人T细胞的PDCD1基因座

研究人员通过融合HER2的胞外结构域III、结构域IV和跨膜结构域构建了tHER2，并将其置于外源EF1α启动子驱动下克隆至rAAV6。利用Cas12a/AAV递送系统，设计了靶向PDCD1第二外显子的crRNA。电穿孔Cas12a RNP并用tHER2编码的AAV病毒转导后，PCR分析证实了tHER2在基因组水平的定点整合。流式细胞术结果显示，来自不同供者的T细胞均稳定表达tHER2，整合和表达效率约为50%。

2. 赫赛汀介导体外tHER2阳性T细胞的清除

通过建立体外ADCC模型，将原代NK细胞与同一供者的PD1^KO-tHER2⁺ T细胞共培养。流式分析表明，在较低NK:T比例（1:5）和低浓度赫赛汀（100 ng/mL）处理24小时后，NK细胞介导的ADCC清除了约80%的tHER2阳性T细胞；在高浓度（1000 ng/mL）下清除率达95%。在较高NK:T比例（1:2）下，两种浓度的赫赛汀均能在24小时内实现高达99%的近完全清除。

3. tHER2成功整合至TCR样CAR-T细胞并在体内维持强大的ADCC效应

研究人员利用Cas12a/AAV编辑系统，将tHER2和FMC63-STAR构建体分别整合至PDCD1和TRAC基因座，构建了共表达tHER2和FMC63-STAR的T细胞（FMC63-STAR^tHER2）。流式分析确认约25%的细胞呈双阳性。细胞毒性实验表明tHER2安全开关未损害FMC63-STAR-T细胞的抗肿瘤活性。在NCG小鼠白血病模型中，赫赛汀给药后，外周血中HER2阳性T细胞数量在3天后开始下降，10天后几乎检测不到，且小鼠生存期显著缩短，证实了赫赛汀/NK细胞组合能有效清除体内的tHER2阳性STAR-T细胞。

4. 双开关自杀系统tHER2-TK的设计

为结合快速清除与缓慢清除的优势，研究人员将tHER2与HSVTK串联构建了双开关自杀系统tHER2-TK。通过在293T细胞中瞬时转染，免疫印迹分析证实了融合蛋白的成功表达。随后，利用Cas12a/AAV系统将该表达盒定点整合至PBMC的PDCD1基因座，流式细胞术显示tHER2-TK在T细胞膜上的表面展示效率可达约50%。

5. 功能性双开关安全系统对编辑T细胞表现出差异化的清除动力学

在FMC63-STAR-T细胞中整合tHER2-TK后（FMC63-STAR^tHER2-TK），约20%的细胞呈双阳性。功能实验证实tHER2-TK表达不影响CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力。对赫赛汀的响应测试显示，在较高NK:T比例（1:1至1:2）下，赫赛汀浓度大于50 ng/mL时，16小时内即可清除约70%的FMC63-STAR^tHER2-TK T细胞，至第4天接近完全消除（约98%）。而对GCV的响应测试则显示出剂量和时间依赖性的细胞毒性：即使低浓度GCV（1 μg/mL）在暴露2天后也能诱导显著的细胞死亡，而更高浓度（12.5和25 μg/mL）则在5天内实现近完全清除。这表明tHER2/ADCC系统在早期阶段更快、更高效，而HSVTK/GCV系统则呈现更渐进的调控特征。

6. FMC63-28ζCAR^tHER2-TK和STAR^tHER2-TK在体内赋予强大的HSVTK/GCV自杀功能

在NCG小鼠Raji-luc肿瘤模型中，分别输注FMC63-28ζCAR^tHER2-TK或FMC63-STAR^tHER2-TK T细胞后，给予GCV治疗。结果显示，GCV治疗组的小鼠肿瘤进展显著加速，生物发光强度增加。外周血分析表明，经过几轮GCV治疗后，tHER2-TK阳性T细胞急剧减少，首次GCV给药后12天左右几乎完全清除。GCV治疗组小鼠的生存期显著缩短，而PBS对照组小鼠存活超过45天。

7. 安全开关不损害工程化T细胞的效应功能

通过体外和体内实验比较，携带tHER2-TK安全开关的CAR-T细胞与常规CAR-T细胞相比，其肿瘤杀伤功能未受损害。在较低效应靶比（E/T=1:10和1:20）下，两者表现出相当的肿瘤杀伤活性。体内抗肿瘤实验同样证实，安全开关的定点整合未削弱CAR-T细胞的肿瘤清除能力。

8. tHER2开关利用磁珠实现tHER2阳性细胞的高效富集

研究人员生产了特异性靶向tHER2的全长抗HER2单克隆抗体，并将其化学偶联至纳米磁珠。流式分析表明，该自制抗体与商业抗HER2抗体具有一致的结合特异性。利用该抗体偶联磁珠对FMC63-28ζCAR^tHER2-TK和FMC63-STAR^tHER2-TK T细胞进行磁性分选，获得了约90%的纯度，与FACS分选的纯度相当。

讨论与结论总结

在讨论部分，研究人员指出，将CAR构建体插入T细胞或进行基因编辑存在插入突变、脱靶效应和致癌转化的风险。本研究开发的优化双价安全开关（tHER2-TK）可用于时间高效的体外纯化、体内追踪以及速率可调的输注T细胞清除，旨在增强下一代T细胞疗法的安全性和可控性。该双开关系统允许通过两种临床可及的药物独立或同时激活：单克隆抗体赫赛汀（触发NK细胞介导的ADCC）和小分子药物GCV（激活HSVTK通路）。tHER2组件可实现快速高效的靶细胞清除，而HSVTK组件则介导更依赖于GCV剂量的延迟清除。两者的结合提供了冗余的互补控制，可根据具体临床情境选择快速或渐进清除，最大化降低毒副作用而不牺牲疗效。与基于西妥昔单抗的开关相比，tHER2开关虽与曲妥珠单抗相关的已知心脏毒性有关，但这些风险是在慢性、重复给药的乳腺癌治疗方案中确立的，而本安全开关设计用于低剂量、单次给药，仅在临床需要快速清除过继转移细胞时使用，这从根本上减轻了心脏毒性担忧。研究也承认其局限性：实验在免疫缺陷小鼠模型中进行，无法评估转基因蛋白（tHER2和HSVTK）在功能完整的人类免疫系统中的潜在免疫原性。HSVTK作为病毒蛋白，在免疫功能健全的宿主中可能引发免疫介导的清除，这是其相对于单独使用tHER2的一个劣势。未来的工作将致力于通过表位工程去免疫化HSVTK蛋白，同时在更先进的免疫健全模型中进行评估，并简化制造流程以推动临床转化。

研究结论：研究人员已构建了一个多功能且高效的双靶点安全开关系统，解决了以往平台的局限性。tHER2-TK开关为工程化T细胞提供了灵活、快速且双价的安全控制，并辅以可规模化生产高质量产品的制造工艺。该策略通过允许在治疗的任何阶段使用单克隆抗体或小分子药物，减轻了急性毒性和长期致瘤潜力的风险，显著提升了ACT的安全性。此外，它提供了一种保障机制，能够在不影响治疗效果的前提下实现及时干预和提高安全性，从而促进更安全、更可控的基于CAR-T的癌症免疫疗法的发展。