进化工程驱动谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）全细胞催化实现d-葡萄糖向低热量甜味剂d-阿洛酮糖（d-allulose）的温和转化

《TRENDS IN Biotechnology》：Microbial production of the low-caloric sweetener d-allulose from d-glucose by evolutionary engineering

　　

d-阿洛酮糖（d-allulose）是一种低热量天然甜味剂，被视为d-蔗糖（d-sucrose）和高果糖玉米糖浆（high-fructose corn syrup，HFCS）的有前景替代品。目前的d-阿洛酮糖生产依赖于约60°C下运行的固定化酶。本研究中，研究人员开发了一种全细胞工艺，可在30°C下将d-葡萄糖转化为d-阿洛酮糖，消除了对酶纯化与固定化的需求。为克服该温度下d-葡萄糖向d-果糖转化低效的瓶颈，研究人员对一个细菌选择菌株实施了适应性实验室进化（adaptive laboratory evolution，ALE），该菌株的生长严格依赖于d-葡萄糖异构酶（d-glucose isomerase）活性。由此获得的改良型d-葡萄糖异构酶变体，以及显著增强糖摄取能力的突变，被整合入一株高表达d-阿洛酮糖3-表异构酶（d-allulose 3-epimerase）的高度工程化底盘菌株中；结合第二轮ALE实验，d-阿洛酮糖得率最高达19%，超过了高温条件下采用固定化酶所得得率。上述发现共同确立了一种利用微生物全细胞催化剂克服无细胞酶法工艺局限的策略，为食品工业提供了替代性解决方案。

**研究背景与科学问题**

当前，d-蔗糖与HFCS等高热量甜味剂的过度摄入与肥胖、2型糖尿病及心血管疾病等多种健康问题密切相关。低热量甜味剂作为替代品受到广泛关注，其中d-阿洛酮糖（d-allulose，亦称d-psicose）是一种稀有天然糖，为d-果糖的C3表异构体，其甜度可达d-蔗糖的70%，而热量不足后者的10%（≤0.4 kcal/g），且已获得美国FDA一般认为安全（generally recognized as safe，GRAS）认证，并与降低血糖、减轻体重等潜在健康效应相关。市场层面，2024年全球d-阿洛酮糖市场规模约1.48亿美元，预计2025至2034年间以14%的年复合增长率扩张。工业上，d-阿洛酮糖生产主要依赖约60°C下运行的固定化酶反应器：以d-葡萄糖为原料时，需先经d-葡萄糖异构酶（其本质为生理功能为催化d-木糖向d-木糖醇转化的d-木糖异构酶，d-xylose isomerase，本研究统一称d-葡萄糖异构酶）异构化为d-果糖，再经d-阿洛酮糖3-表异构酶或d-塔格糖3-表异构酶（d-tagatose 3-epimerase）表异构化，得率仅10–16%。核心矛盾在于：d-葡萄糖异构酶对d-葡萄糖的亲和力极低（Km值通常高于100 mM），而微生物胞内游离糖浓度因即时代谢而远低于此，故工业上必须在60–70°C操作以补偿嗜温温度下的低活性并移动热力学平衡，但≥50°C的高温又导致表异构酶稳定性下降，只能依赖固定化维持可复用性。因此，如何在温和温度（30°C）下实现胞内d-葡萄糖向d-果糖的高效异构化，成为突破该工艺的关键科学问题。

**研究内容、主要结论与意义**

研究人员以已用于百万吨级氨基酸生产的工业微生物谷氨酸棒状杆菌为底盘，围绕上述瓶颈，通过"生长耦联选择—适应性实验室进化—反向工程验证—分子动力学机制解析"的研究路径，获得了兼具高活性d-葡萄糖异构酶变体（XylA^AB-S2F、XylA^AB-c_t、XylA^XC-W147S）与高摄取能力糖转运蛋白变体（IolT1-G87S、IolT1-T351P）的菌株，并进一步敲除PTS系统相关基因、肌醇脱氢酶旁路基因及ptsS，经第二轮ALE获得无需诱导剂即可组成型表达的重排质粒，最终在30°C下将d-葡萄糖转化为d-阿洛酮糖，得率最高达19%，超越固定化酶高温工艺的10–16%，且省去了酶纯化、固定化、高温操作及诱导剂成本。该工作发表于生物技术领域期刊《TRENDS IN Biotechnology》，为食品工业提供了一条更温和、更节能的甜味剂制造路线。

**关键技术方法**

本研究的实验菌株均为研究人员自行构建，未涉及临床或外部样本队列。研究人员主要采用：（1）生长耦联选择系统，敲除ptsG与ptsF阻断PTS摄取，并解除转录调控因子IolR对iolT1的抑制使其组成型表达，构建出在30°C下生长严格依赖d-葡萄糖异构酶活性的选择菌株Fruneg；（2）适应性实验室进化（ALE），以d-果糖为唯一碳源进行多轮传代筛选快速生长克隆；（3）反向工程（reverse engineering），将进化所得单点突变以单突变或组合形式回补亲本株以验证功能；（4）全原子分子动力学模拟（molecular dynamics，MD）结合分子力学泊松-玻尔兹曼表面积（MM-PBSA）有效结合能计算，解析IolT1、XylA^XC及PtsS突变的结构与结合机制；（5）基于约束网络分析（constraint network analysis，CNA）的动态变构模型，量化突变对关键跨膜螺旋刚性/柔性的远程影响；（6）基于同源重组与pK19mobsacB载体的一步/两步基因编辑构建系列缺失株。辅助手段包括Western blot、RT-qPCR、Ni-NTA亲和层析与尺寸排阻色谱纯化酶、比色法酶动力学分析及HPLC糖定量。

**研究结果**

30°C下高体内d-葡萄糖异构酶活性的生长选择：研究人员将7种已报道的d-葡萄糖异构酶基因克隆至Fruneg，在d-果糖培养基中测试生长；其中源自Arthrobacter sp. NRRL B3728（XylA^AB）与Xanthomonas campestris（XylA^XC）的酶使菌株生长速率最高且d-果糖消耗最完全，被选为进化对象。

携带xylA表达质粒的Fruneg菌株的ALE：经3–5轮、总计45–55天的传代，6个独立进化克隆的生长速率与细胞密度均大幅提升并耗尽d-果糖。全基因组与质粒测序显示突变仅集中于两个靶点：XylA（S2F替换、翻译起始区上游20 bp的c-to-t突变，以及三次独立进化中一致出现的W147S替换）和质子耦联次级转运蛋白基因iolT1（G87S或T351P替换）。

反向工程验证突变相关性：单独引入iolT1突变使生长速率提升3–7倍，高于xylA突变至多2倍的贡献；唯有IolT1与XylA突变组合才能复现ALE菌株的生长与d-果糖消耗表型；RT-qPCR证实各突变株间iolT1与xylA转录水平无差异，表明表型源于突变本身而非表达差异。

IolT1突变对d-果糖与d-葡萄糖转运动力学的影响：表达ScrK果糖激酶以恢复代谢的菌株显示，G87S与T351P使d-果糖摄取的μ_max提高约10倍、表观K_s降低10–32%；对d-葡萄糖同样使μ_max接近翻倍、K_s降低4–14倍，证实两突变均显著增强两种己糖的非磷酸化摄取。

IolT1变体的分子动力学模拟：折叠自由能变化（ΔΔG）分析显示各突变ΔΔG小于3 kcal/mol，不破坏结构稳定性；动态变构模型表明G87S与T351P以变构方式远程影响与碳水化合物结合相关的290–306与390–401螺旋（在人葡萄糖转运蛋白GLUT中对应TM7b/TM10b），效应强度T351P>G87S>G87S-T351P，与生长表型顺序一致；d-葡萄糖结合强于d-果糖（β-D-果糖呋喃糖BFF结合能不利），解释了两种糖转运的差异；盐桥重置过程未受影响。

XylA突变对动力学性质的影响：Western blot显示S2F与c_t突变通过提高XylA蛋白含量增强活性；对XylA^XC，W147S使其对d-葡萄糖的K_cat/K_m提高8.4倍（达5.9 s^-1M^-1），而对d-木糖活性下降2.6倍，实现底物偏好重塑；进一步随机突变筛选获得温和提升活性的G15A变体。

XylA^XC变体的MD模拟：MM-PBSA计算表明W147S有利于d-葡萄糖-Mg²⁺与酶的结合，可能通过稳定活性中心相互作用网络与金属配位环境形成更适合d-葡萄糖的结合构象。

葡萄糖阴性菌株的工程化：缺失glk、ppgK、nanK后菌株仍出现长延滞期后的d-葡萄糖生长抑制子；基因组测序发现iolR或ihtR失活突变，解除抑制后诱导的肌醇脱氢酶（IolG、OxiE、OxiD）可将d-葡萄糖氧化为d-葡糖酸从而供能；删除iol1、iol2基因簇及idhA3后，菌株在d-葡萄糖中100小时无生长，获得稳定的葡萄糖阴性底盘Gluneg。

利用Gluneg菌株生产d-阿洛酮糖：比较三种表异构酶后，源自Agrobacterium tumefaciens的Dae_AT效率最高（22.3%得率）；组合XylA^XC-W147S-G15A与IolT1^G87S后得率达10.2–10.9%。

PtsS侧活性的证据：生产菌株出现意外生长，ALE获得ptsS的A129G突变；该突变使原本对d-蔗糖特异的PTS-EII转运蛋白PtsS获得共转运d-葡萄糖与d-果糖（生成d-葡萄糖6-磷酸）的能力，MD模拟显示A129G增强催化隧道对d-葡萄糖及d-葡萄糖-d-果糖复合物的结合而削弱对d-蔗糖的结合。

删除ptsS与第二轮ALE：缺失ptsS使d-阿洛酮糖产量与得率分别提高33%与39%，达4.6 g/l与15.1±0.5%；针对d-阿洛酮糖耐受株的ALE获得缺失lacI及部分tac启动子的重排质粒pPRAL-xylA^XC-G15A-W147S-daeAT，实现组成型表达、无需IPTG，最终得率达18.5±0.7%（约19%）。

**讨论与结论**

讨论部分指出，d-葡萄糖异构化受制于高Km与低胞质浓度的双重限制，且谷氨酸棒状杆菌经PTS摄取的糖为磷酸化形式、无法充当其底物；通过IolT1突变增强非磷酸化摄取、XylA突变增强催化活性，二者协同破解了该瓶颈。IolT1^G87S与IolT1^T351P带来的约10倍摄取提升，对需避免PTS以节省磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）前体的芳香族化合物等代谢工程具有普适工具价值；XylA^XC-W147S则为从d-葡萄糖微生物合成二糖甜味剂、膳食补充物乃至5-羟甲基糠醛等d-果糖衍生物提供新酶元件。葡萄糖阴性株的构建颇具挑战，因肌醇脱氢酶旁路极易被诱导激活；PtsS的A129G揭示该转运蛋白可能具弱共转运活性，机制仍需深究。删除ptsS并组合进化元件后得率约19%，优于≥60°C固定化酶工艺的10–16%，且省去纯化、固定化、高温与诱导剂。作者同时承认异构化与表异构化的可逆性带来热力学固有限制，未来可尝试阻止d-果糖外排、选择性外排d-阿洛酮糖以移动平衡，但相关转运蛋白尚属未知。

研究结论认为，该工作建立了在30°C下高效将d-葡萄糖转化为d-阿洛酮糖的全细胞平台，证明微生物催化剂可承担目前依赖纯化酶、固定化与高温的转化过程；若实现工业化，可将众多食品饮料中的d-葡萄糖与d-果糖转化为d-阿洛酮糖，从而降低热量、助力公共健康。其意义超越d-阿洛酮糖本身：结合ALE与代谢工程，研究人员在嗜温温度下实现了高效胞内糖异构化，为以蔗糖、淀粉或糖蜜等廉价碳源生产d-阿洛酮糖及其他d-果糖衍生物开辟了更广的应用前景。