急性肺栓塞中内质网应激与细胞凋亡循环标志物的前瞻性病例对照研究

《Cell Stress and Chaperones》：Circulating Markers of Endoplasmic Reticulum Stress and Apoptosis in Acute Pulmonary Embolism: A Prospective Case-Control Study

　　

急性肺栓塞（PE）是静脉血栓栓塞症（VTE）的潜在致命性表现，也是心血管疾病发病和死亡的重要原因。急性肺动脉床阻塞会导致肺血管阻力（PVR）和右心室后负荷骤增。这些血流动力学改变可能伴随通气-灌注（V/Q）比例失调、低氧血症、交感神经激活及血栓炎症反应。上述过程可破坏细胞能量代谢、钙稳态和氧化还原平衡，从而诱发多种细胞应激反应。尤其是维持蛋白质正确折叠所需的能量与氧化还原条件受到干扰，可能损害内质网（ER）的蛋白质稳态（proteostasis）。ER是参与蛋白质合成、折叠与质量控制以及细胞钙稳态和脂质生物合成调控的重要膜性细胞器。ER腔内未折叠或错误折叠蛋白的蓄积可诱导ER应激。细胞对此的应答是激活未折叠蛋白反应（UPR），该反应是由肌醇需求酶1（IRE1）、蛋白激酶R样ER激酶（PERK）和激活转录因子6（ATF6）这三种经典跨膜感受器介导的、进化上保守的适应性程序。GRP78/BiP是维持蛋白质稳态并调控三种经典UPR感受器的主要ER分子伴侣。在ER应激状态下，IRE1、PERK和ATF6信号通路的激活会启动旨在减轻蛋白质折叠负担并恢复ER稳态的适应性反应。IRE1调控X盒结合蛋白1（XBP1）mRNA的非经典剪接，而PERK通过eIF2α磷酸化和ATF4信号调节翻译及转录应激反应。ATF6从ER易位至高尔基体，在该处经位点1和位点2蛋白酶的顺序性蛋白水解切割，生成作为UPR相关基因转录调节因子的N端p50片段。然而，当ER应激严重或持续时，适应性能力可能被超越，促凋亡信号（尤其是通过C/EBP同源蛋白，CHOP）可能占据主导。评估伴随ER应激发生的细胞死亡，可为该反应的生物学后果提供补充性认识。细胞角蛋白18（CK18）是一种主要表达于上皮细胞的中间丝蛋白。在凋亡过程中，caspase介导的CK18切割暴露出可被M30抗体识别的特定新表位；而基于M65的检测可同时检出切割和未切割的CK18，因此反映更广泛的上皮细胞死亡负荷。据此，CK18-M30提供关于凋亡性上皮细胞死亡的更特异信息，而CK18-M65则反映总体上皮细胞死亡负荷。CK18类生物标志物已在肿瘤学、肝病学和重症医学领域得到广泛研究。鉴于肺具有广泛的肺泡和支气管上皮表面，循环CK18片段也可能为肺部疾病中的上皮损伤和细胞死亡提供信息。实验和临床证据提示ER应激与UPR信号参与动脉粥样硬化、心力衰竭、肺动脉高压以及多种急慢性肺部疾病的病理生理过程。然而，急性PE中的循环UPR相关特征仍研究不足。据研究人员所知，尚无全面的临床研究在急性PE中同时评估与全部三种经典UPR分支相关的循环标志物，并在同一分析框架内整合GRP78、促凋亡效应分子CHOP和基于CK18的细胞死亡标志物。在指示性静脉血栓栓塞事件时存在短暂或持续诱发危险因素，对复发风险评估和抗凝疗程具有重要影响。在本研究中，存在可识别诱发危险因素的患者被归类为诱发性PE，而无明确诱发因素者被归类为特发性PE。这些组别在急性血栓栓塞事件期间是否表现出不同的细胞应激反应仍不清楚。由于手术、创伤和制动等诱发条件可能伴随组织损伤、全身炎症和代谢应激，它们也可能改变ER应激相关反应。因此，比较诱发性与特发性PE之间的循环UPR相关特征，可能有助于认识仅凭常规临床分类无法捕捉的生物学异质性。本研究的主要目的是比较对照组以及诱发性或特发性急性PE患者之间IRE1、PERK、ATF6、蛋白水解切割型ATF6-p50、GRP78、CHOP、CK18-M30和CK18-M65的循环水平。次要目的是考察这些标志物与选定临床和实验室指标（包括D-二聚体、肌钙蛋白、C反应蛋白（CRP）、肺动脉收缩压和血栓位置）之间的关系。

研究背景：急性肺栓塞（PE）是静脉血栓栓塞症（VTE）的潜在致命表现，可导致肺血管阻力（PVR）和右心室后负荷骤增，并伴随通气-灌注比例失调、低氧血症、交感激活与血栓炎症反应，进而破坏细胞能量代谢、钙稳态与氧化还原平衡，损害内质网（ER）的蛋白质稳态。ER应激可激活未折叠蛋白反应（UPR），由IRE1、PERK和ATF6三种经典感受器介导；应激严重或持久时，促凋亡效应分子CHOP介导的信号占优。细胞角蛋白18（CK18）在凋亡中被caspase切割，CK18-M30反映凋亡性上皮细胞死亡，CK18-M65反映总体上皮细胞死亡负荷。既有证据提示ER应激参与动脉粥样硬化、心力衰竭、肺动脉高压及多种肺部疾病，但急性PE的循环UPR相关特征研究不足，且尚无临床研究同时评估三种经典UPR分支相关标志物并整合GRP78、CHOP及CK18类标志物。此外，诱发性与特发性PE在急性事件期间的细胞应激反应是否存在差异尚不清楚，而诱发因素本身可能通过组织损伤、炎症和代谢应激改变ER应激相关反应。因此，本研究旨在比较对照组与诱发性、特发性急性PE患者上述8种标志物的循环水平，并考察其与D-二聚体、肌钙蛋白、CRP、肺动脉收缩压及血栓位置的关系。

研究方法：采用单中心前瞻性病例对照设计；2026年1月至4月连续纳入急诊经CT肺动脉造影（CTPA）确诊、症状出现48小时内且于抗凝或溶栓前采血的急性PE患者，按入院时有无可识别诱发因素（既往3个月内大手术、创伤或制动）分为诱发性PE（30例）与特发性PE（30例）；对照组为同期常规健康体检志愿者30例。排除活动性感染或脓毒症、近3个月急性冠脉综合征或卒中、慢性肝病、晚期慢性肾病、活动性恶性肿瘤、自身免疫或慢性炎症性疾病、妊娠或哺乳及VTE病史者。共评估83例患者，排除23例，最终PE队列60例，总研究人群90例。血液样本于4 °C、3000 rpm离心10分钟分离血清并保存于?80 °C。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定IRE1、PERK、ATF6、切割型ATF6-p50、GRP78、CHOP、CK18-M30和CK18-M65，检测人员对分组设盲。主要终点为三组间上述标志物差异；次要终点为标志物与临床实验室变量的关系；判别性能、logistic回归等为探索性分析。样本量按每组30例设定（基于三组人体病例对照研究中血清GRP78的效应量Cohen's f = 0.60及可行性），并对最终90例进行敏感性分析，在Bonferroni校正α = 0.00625、90%检验效能下最小可检测效应量约为Cohen's f = 0.47。统计分析采用SPSS 25.0，非正态分布标志物用Kruskal–Wallis H检验及Dunn事后检验（Bonferroni校正），趋势分析用Jonckheere–Terpstra检验，效应量用ε2，相关性用Spearman秩相关，判别性能用受试者工作特征（ROC）曲线分析，关联性用单因素二元logistic回归。

研究结果：（1）人口学、临床与常规实验室特征：三组在年龄、性别、体质指数及糖尿病、高血压、慢性阻塞性肺疾病、冠心病患病率上均无显著差异；两PE组间合并深静脉血栓（DVT）比例、肺动脉收缩压及血栓位置分布亦无显著差异。两PE组的D-二聚体、CRP、肌钙蛋白、白细胞、中性粒细胞、单核细胞和血糖均显著高于对照组，白蛋白显著低于对照组；淋巴细胞差异仅见于特发性PE与对照组之间；上述常规指标在两PE组间均无显著差异。（2）内质网应激与凋亡标志物：8种标志物在三组间差异均有统计学意义（均p < 0.001），且均低于Bonferroni校正阈值α = 0.00625；效应量均较大，以切割型ATF6-p50最大（ε2 = 0.817），其次为IRE1（ε2 = 0.546）和CK18-M30（ε2 = 0.503）。所有标志物中位数均呈对照组最低、特发性PE居中、诱发性PE最高的单调递增（Jonckheere–Terpstra检验均p < 0.001）。对照组与两PE组间8种标志物均有显著差异；除GRP78在两PE组间无显著差异（p = 0.056）外，其余7种标志物在诱发性PE中显著高于特发性PE。（3）标志物的判别性能：区分PE与对照时，切割型ATF6-p50的曲线下面积（AUC）最高（0.991；95%置信区间（CI）0.973–1.000；p < 0.001），在≥3.26 ng/mL界值时灵敏度93.3%、特异度100.0%；IRE1（AUC = 0.916）与CK18-M30（AUC = 0.905）次之，其余标志物AUC为0.809–0.862，均显著大于0.50。区分诱发性与特发性PE时，切割型ATF6-p50的AUC仍最高（0.934；95% CI 0.868–1.000；p < 0.001），在≥5.60 ng/mL界值时灵敏度83.3%、特异度100.0%；其余ER应激与凋亡相关标志物AUC为0.701–0.782；而D-二聚体（AUC = 0.639；p = 0.052）和CRP（AUC = 0.549；p = 0.513）未显示显著判别能力。（4）相关性分析：在总体研究人群中，8种标志物均与D-二聚体、CRP、肌钙蛋白、白细胞、中性粒细胞和血糖正相关，与白蛋白负相关；但仅限PE患者分析时，均与D-二聚体、CRP、肌钙蛋白及肺动脉收缩压无显著相关。PE患者中，PERK与中性粒细胞计数正相关（ρ = 0.421；p = 0.001），CK18-M65与血栓位置趋近端正相关（ρ = 0.347；p = 0.007）；GRP78与中性粒细胞计数、PERK与白细胞计数、CK18-M30与血栓位置、PERK与血栓位置、GRP78与血糖亦呈正相关。标志物间相关分析显示PERK与GRP78（ρ = 0.576）、IRE1与PERK（ρ = 0.560）、IRE1与CHOP（ρ = 0.528）、IRE1与GRP78（ρ = 0.516）、CHOP与CK18-M30（ρ = 0.496）、CK18-M30与CK18-M65（ρ = 0.485）显著相关（均p < 0.01），而切割型ATF6-p50与其他标志物相关性较弱（ρ = 0.113–0.302）。（5）logistic回归分析：单因素二元logistic回归中8种标志物均与PE状态显著相关；切割型ATF6-p50每升高1 ng/mL与PE相关（比值比（OR）= 10.58；95% CI 3.40–32.95；p < 0.001），Nagelkerke R2为0.888，IRE1为0.629，CK18-M30为0.547。（6）按血栓位置的发现：PE患者按最近端血栓位置分为段动脉（16例）、叶动脉（23例）和主肺动脉（21例）组。肌钙蛋白、D-二聚体和肺动脉收缩压在3组间差异显著并随位置趋近端单调升高。CK18-M65随血栓位置差异显著（段动脉组中位数938.8 ng/L、叶动脉组1193.7 ng/L、主肺动脉组1929.7 ng/L；Kruskal–Wallis p = 0.018；Jonckheere–Terpstra p = 0.005）；CK18-M30与PERK总体差异未达显著（p = 0.057和p = 0.107），但均随位置趋近端呈显著单调升高（p = 0.034和p = 0.037）；CHOP与IRE1趋势未达显著；GRP78、切割型ATF6-p50和ATF6未见显著差异或趋势。

讨论与结论：本研究显示PE患者循环中三种经典UPR感受器（IRE1、PERK、ATF6）及切割型ATF6-p50、GRP78、CHOP和上皮细胞死亡标志物CK18-M30、CK18-M65均显著高于对照，且标志物间相关提示为涉及多分支的协同性循环应激反应谱，但循环蛋白浓度不能直接等同于细胞内或组织水平的UPR激活。低氧、右心室血流动力学负荷及血栓炎症（包括中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），本研究中PERK、GRP78与中性粒细胞计数正相关，但未直接检测NETs）可能是潜在机制。切割型ATF6-p50效应量最大、判别性能最高且与其他标志物相关性较弱，提示ATF6蛋白水解加工可能是急性PE相关循环应激谱的突出成分，但其检测的分子特异性未获独立正交方法验证，界值亦未外部验证。CHOP与CK18-M30正相关，提示ER应激相关反应与凋亡性上皮细胞死亡信号可能存在生物学联系，但横断面设计不能确立因果；CK18来源组织无法确定。CK18-M65随血栓位置趋近端而升高，提示近端血管阻塞可能与更大的上皮损伤和细胞死亡负荷相关，但血栓位置并不直接反映血栓体积、肺梗死范围或实质损伤程度。诱发性PE中除GRP78外的7种标志物显著高于特发性PE，而D-二聚体、CRP、肌钙蛋白、白细胞计数和肺动脉收缩压无显著差异；诱因（手术、创伤、制动）可能带来超出血栓栓塞事件本身的系统性生物学负荷，但各诱因未作亚组分析，该解释仅为待验证假设。GRP78在两PE组间无差异提示应激反应各成分并不均一。总体人群中标志物与D-二聚体、CRP、肌钙蛋白等的相关性在仅限PE患者时大多消失，提示其主要由病例与对照间的显著分离驱动，而非PE人群内疾病严重度的连续梯度。研究优势包括前瞻性设计、CTPA确诊、抗凝或溶栓前采血、同一框架内比较诱发性与特发性PE、多重检验校正及效应量报告、总体人群与PE队列分别进行相关分析；局限性包括单中心、样本量有限、诱因重叠且未作因素特异性比较、单时点测量、循环蛋白不能直接反映组织UPR激活、切割型ATF6-p50分析特异性未独立验证、未行遗传性易栓症检测、ROC界值未外部验证、次要分析为探索性以及缺乏纵向预后数据。研究结论（翻译）：急性PE与涉及UPR多个成分的循环生物标志物的协同性改变以及上皮细胞死亡信号增强相关。诱发性PE中观察到更显著的标志物谱，而常规血栓、炎症或血流动力学指标并无相应区别，提示ER应激相关反应可能反映了常规疾病严重度指标未能完全捕捉的急性PE的某一生物学维度。切割型ATF6-p50独特的循环特征及所观察到的高判别性能，连同CK18-M65与血栓位置趋近端之间的关联，凸显了ATF6加工和细胞死亡通路与急性PE病理生物学之间的潜在相关性。总体而言，这些发现支持将ER应激–UPR–细胞死亡轴作为急性PE生物学异质性潜在组成部分加以进一步研究。需要更大规模、纵向及机制性研究来明确这些循环标志物的细胞来源和时间动态，独立验证切割型ATF6-p50的判别性能，并确定该分子谱是否与复发及其他临床相关结局相关。