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尽管“泛基因组”这一术语起源于微生物物种的研究，但近年来真核生物泛基因组学的进展主要受到群体规模真核生物数据集所带来的巨大计算挑战的驱动。本综述评估了现有真核生物泛基因组工具和方法在多大程度上可扩展应用于微生物物种。我们首先概述了当前真核生物和微生物泛基因组学
尽管“泛基因组”这一术语起源于微生物物种的研究，但近年来真核生物泛基因组学的进展主要受到群体规模真核生物数据集所带来的巨大计算挑战的驱动。本综述评估了现有真核生物泛基因组工具和方法在多大程度上可扩展应用于微生物物种。我们首先概述了当前真核生物和微生物泛基因组学的研究方法，随后重点考察了将真核生物方法适配至微生物基因组时面临的机遇与挑战，特别关注可扩展性（scalability）、数据质量（data quality）、进化复杂性（evolutionary complexity）和基准评测（benchmarking）等方面。最后，研究人员指出了现有方法能够较好泛化的领域，以及需要进行实质性重新设计与开发的关键环节。
主体内容总结
将泛基因组学带回微生物
泛基因组最初是在微生物基因组学背景下提出的，其原始定义指某一物种所有分离株中观察到的基因集合，分为核心（core）和附属（accessory）组分。随着时间推移，泛基因组的概念已大幅扩展，可指参考基因组集合、遗传变异目录，或总结同物种个体间基因组多样性的计算表示（如泛基因组图）。泛基因组图是将同源基因组区域折叠为共享节点、将替代等位基因或结构重排表示为图中不同路径的一种表示框架。人类泛基因组图的发展主要受大规模高质量基因组测序可行性提升的推动，例如人类泛基因组参考联盟（Human Pangenome Reference Consortium）最初发布了47个分相二倍体组装。微生物泛基因组学面临与真核系统根本不同的生物学和计算挑战：微生物群体在基因组结构上表现出非凡的可变性，涉及相变异（phase variation）、非同源重组（nonhomologous recombination）和广泛的拷贝数变异（copy number variation）。此外，微生物数据集可能存在组装碎片化、污染、菌株混合以及附属内容恢复不完整等问题，这对宏基因组组装基因组（metagenome-assembled genomes, MAGs）尤为重要。多分体基因组（multipartite genomes）、质粒（plasmids）、前噬菌体（prophages）、转座子（transposons）以及整合性接合元件（integrative and conjugative elements）进一步增加了基因组表示和注释的复杂性。目前已开发多种微生物泛基因组工具，包括Roary、Panaroo、panX、PIRATE和PPanGGOLiN，Piggy则通过纳入基因间变异补充了基于基因的泛基因组方法。
真核生物泛基因组工具概述
真核生物泛基因组学的最新进展主要集中在构建、比对、可视化和验证泛基因组图的工具开发上。泛基因组图的最宽泛定义是一种基于图的基因组集合表示，其中节点对应基因组序列或区域，边连接在一个或多个基因组中相邻的区域。人类泛基因组研究联盟首版泛基因组图包含47个分相二倍体组装（94个单倍型），使用PGGB构建的图大小仅约8 GB，包含超过1亿个节点，远小于94个单倍型的线性表示（282 GB）。泛基因组构建工具的主要差异在于同源性推断方式、图结构中的变异表示方式以及新基因组加入时稳定坐标系的维持方式。成对全基因组比对工具如Minimap2、Wfmash、FastGA和SegAlign可高效扩展至大型组装集合；多序列和多基因组比对方法如MultiZ、Cactus和Progressive Cactus则试图保持基因组间全局一致的同源关系。部分序比对（partial-order alignment, POA）方法包括abPOA、spoa和poasta。比对结果随后通过参考引导或参考无关的构建范式转化为泛基因组图。参考引导方法如Panaln、vg construct、Minigraph和Minigraph-Cactus保留指定骨架基因组并将变异编码为相对该参考的替代图路径；参考无关工具如seqwish、impg、AlfaPang和pggb则直接从观察序列构建图而不特选单一组装。坐标系的维持是真核泛基因组表示的主要挑战，参考锚定坐标系和路径中心坐标系各有不同的下游工具支持。可视化工具方面，ODGI和Waragraph强调大规模变异图的可扩展探索，Sequence Tube Map以彩色“管道”渲染单倍型和结构变异，Bandage、GfaViz、MoMI-G、PanGraphViewer和VRPG等支持不同场景的图检查。基准评测和验证工具包括pgge（基于比对的构建准确性和映射性能评估）和PG-SCUnK（通过单拷贝通用k-mer量化评估图的代表性）。
微生物泛基因组工具概述
微生物基因组比真核基因组小得多且更紧凑，编码序列通常占基因组的85–90%以上，这种高编码密度催生了基于基因的微生物泛基因组表示方法。现有微生物泛基因组工具可分为三类：基于基因（gene-based）、基于基因组（genome-based）和基于k-mer（k-mer-based）的方法。基于基因的工具主要包括PATO、Panakeia、PanTA、RIBAP、SCARAP和PGAP2等，这些工具通过蛋白质序列聚类并辅以马尔可夫聚类（Markov Clustering）或基于图的后处理来解析不同相似度水平的基因家族。基于基因组的方法包括pandora、PanGraph和tMHG-finder，它们直接在完整基因组组装上操作，不依赖基因预测。pandora利用578个基因组构建的图在大肠杆菌（Escherichia coli）分析中恢复了比单参考方法更多的稀有单核苷酸变异。DrPRG基于pandora扩展用于结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）耐药相关位点的变异表示，在部分药物的耐药预测中优于现有工具。基于k-mer的工具如Pangrowth将基因组抽象为k-mer集合，利用Heap定律估计泛基因组的开放性。
从真核到微生物泛基因组学
在计算、可扩展性和可解释性挑战方面，微生物泛基因组的大小和动态特性引入了与人类泛基因组学根本不同的挑战。在2000个采样基因组时，无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的泛基因组已超过人类基因组约20000个基因的数量；在4000个基因组时，铜绿假单胞菌泛基因组扩展至近40000个基因。微生物HGT和快速基因组更替进一步增加了泛基因组开放性。图2B显示minigraph构建100万个基因组的泛基因组图预计需要接近1000万CPU小时。大型泛基因组还带来显著的可视化瓶颈，且微生物中不存在单一的泛基因组规模概念，不同物种间差异巨大。
在数据和数据库考虑方面，微生物泛基因组的生物学效用和可解释性受基因组数据组成、质量和注释及其相关分类学的强烈影响。全基因组测序通常被视为高质量组装的金标准，但许多微生物难以培养，MAGs提供了重要替代方案。高保真长读长测序可显著改善MAG质量。泛基因组工作流应实施标准化和分阶段的质量控制流程。广泛使用的数据库包括RefSeq、GTDB和AllTheBacteria，各有优缺点。此外还有针对移动遗传元件、毒力因子和抗菌素耐药基因的专门数据库，如ISFinder、ICEberg、VFDB、CARD和MEGARes。
在进化和系统发育复杂性方面，细菌进化时间尺度远短于真核生物，受生态选择压力、HGT和重组强烈影响。基于基因的基因组视图在表征细菌群体方面可能适用性有限，水平进化事件可跨越亚基因单元导致基因内杂交。16S rRNA基因曾因普遍性和相对抗HGT性成为细菌系统发育的金标准，但单一基因座分辨率有限。当前领域已转向使用通用标记基因的多位点方法以及显式检测和过滤重组区域的工具如fastGEAR、Gubbins和ClonalFrameML。细菌物种定义及其基因组边界的争议导致群体和分类单元的基本概念不明确。HGT的普遍性意味着细菌进化历史不能完全由单一分叉树描述，祖先重组图（ancestral recombination graphs）和系统发育网络（phylogenetic networks）是补充模型，但两者在个体或分类单元数量及基因座数量上的可扩展性仍受限。泛基因组图可作为树基和网络基细菌进化分析的基础输入，绕过开放阅读框预测和注释质量的依赖，直接促进亚基因水平HGT事件的检测。
在标准、基准评测和可重复性问题方面，模拟数据集正成为微生物基因组学数据生态系统中日益重要的组成部分。社区驱动的模拟资源为建立具有已知真实值的共享基准数据集提供了机会，可提高计算工具间的可重复性和可比性。集中式存储库可能促进基于经验观察或先进进化模拟框架开发的计算密集但生物学上更真实的模拟的开发和重用。大型高质量模拟数据集的可用性可显著加速方法开发，并促进机器学习方法的更广泛采用。
