胎盘小RNA测序揭示子痫前期大鼠模型中独特的microRNA特征及其功能相关性

《Hypertension in Pregnancy》：Placental small-RNA sequencing reveals a distinct microRNA signature and its functional relevance in a preeclampsia rat model

　　

目的：尽管过去几十年进行了大量研究，子痫前期的发病机制中的分子机制仍未被完全阐明。新出现的证据表明，microRNA（miRNA）调控子痫前期的关键病理过程，包括内皮功能障碍、炎症和氧化应激。然而，此前尚未开展全面的miRNA表达谱分析。因此，研究人员采用子痫前期的子宫灌注压降低（RUPP）模型，进行了胎盘miRNA测序，以鉴定异常表达miRNA的功能相关性。方法：于妊娠日（GD）19通过颈动脉插管测量血压。使用Illumina NextSeq2000测序仪进行胎盘小RNA测序。结果：分析鉴定了RUPP大鼠胎盘中142个差异调控的miRNA（40个上调，102个下调）。上调最显著的miRNA包括miR-211-3p、miR-628、miR-6324、miR-363-5p和miR-6329，而下调最显著的是miR-3587、miR-29b-3p、miR-3556a、miR-29a-3p和miR-21-3p。功能注释显示其与免疫反应（miR-363、miR-21、miR-29）、B细胞分化（miR-628）、T细胞活化（miR-21）、脂肪生成和脂质代谢（miR-211、miR-29、miR-21）以及血管生成（miR-363、miR-21）相关。此外，基因本体分析显示在生物学过程方面显著富集：转运调控、细胞间信号传导和钙依赖性胞吐；细胞组分方面：突触囊泡、核周胞质和网格蛋白包被囊泡；分子功能方面：糖蛋白结合、蛋白质二聚化和肌球蛋白结合。结论：这些发现表明RUPP大鼠中显著的miRNA失调可能构成疾病发病机制的基础。

子痫前期是妊娠特有的高血压疾病，以新发高血压和多器官功能障碍为特征，仍是全球孕产妇和胎儿发病与死亡的主要原因。尽管经过数十年研究，其发病机制的分子机制仍未完全阐明，这阻碍了有效生物标志物和治疗手段的研发。胎盘缺血被认为是子痫前期发病的起始事件，胎盘灌注受损导致循环抗血管生成因子（sFlt-1、sEng）和促炎细胞介质释放，共同促成母体内皮功能障碍和高血压。除这些公认的分泌因子外，氧化应激、线粒体功能障碍、凋亡及非编码RNA调控等胎盘机制被认为会加剧胎盘功能障碍。越来越多文献表明miRNA在子痫前期病理中发挥关键作用；miRNA是小的非编码RNA，通过与信使RNA转录本结合在转录后水平调控基因表达。近年来研究报道了子痫前期患者中若干miRNA的异常表达，并在细胞和动物模型中显示其调控滋养细胞侵袭、血管生成和氧化应激等关键过程，例如miR-155过表达可在细胞和啮齿类模型中诱导子痫前期特征。然而，部分研究报告的胎盘miRNA表达模式不一致，难以确定其有效性及在发病机制中的因果作用。RUPP大鼠模型是研究子痫前期的常用动物模型，可重现胎盘缺血和母体高血压等关键临床特征。鉴于miRNA生物学的复杂性，在RUPP大鼠模型中进行无偏倚的miRNA表达谱分析可能为揭示子痫前期胎盘功能障碍和母体疾病的分子机制提供重要见解。因此，本研究对RUPP和健康妊娠对照大鼠的胎盘组织进行全面的小RNA测序，以鉴定失调的miRNA并探讨其功能相关性。

研究人员将妊娠Sprague-Dawley大鼠随机分为正常妊娠（NP）组和RUPP组。于GD14在异氟烷麻醉下将手术银夹（0.203 mm）置于髂分叉上方的腹主动脉（1个夹）及双侧卵巢动脉周围（每侧2个夹）以诱导胎盘缺血。于GD19通过颈动脉插管测量有创血压。测压后立即取出胎胎盘单位，称量单个胎盘和胎儿重量。从每只大鼠随机选取一个胎盘的母体侧取约5 mg组织提取RNA，使用Revvity NEXTFLEX small RNA-Seq kit V4构建小RNA文库，在Illumina NextSeq 2000平台测序。使用R中的DESeq2进行差异表达分析（倍数变化=1.5，校正p=0.05），从TAM 2.0检索失调miRNA的功能关联，分别使用miRTargetLink和Cytoscape对差异表达miRNA及其mRNA靶标进行基因本体分析。数据以均值±标准误（SEM）表示，p≤0.05视为显著。

结果方面，RUPP大鼠模型验证显示，与NP大鼠相比，RUPP大鼠平均动脉血压升高（123.8±1.51 vs. 98.70±1.53 mmHg，n=9–10，p<0.0001），产仔数减少（6.55±1.06 vs. 13.70±0.61，n=9–10，p<0.0001），胎儿体重降低（2.01±0.09 vs. 2.25±0.07 g，n=9–10，p=0.059），胎盘重量无显著差异（0.50±0.03 vs. 0.54±0.02 g，n=9–10，p=0.270）。胎盘miRNA谱分析显示，小RNA测序共鉴定765个miRNA转录本；对NP和RUPP大鼠按转录本表达进行排序，前10位高表达miRNA中8个为两组共有，miR-16-5p和miR-26a-5p为NP组独有富集，miR-291b和miR-291a-3p为RUPP组独有富集；前10位低表达miRNA中9个为两组共有，miR-155-3p和miR-935分别在NP和RUPP组独有低水平检出，提示尽管RUPP存在胎盘缺血，最丰富和最低表达miRNA谱仍基本保留。差异表达分析显示，与NP大鼠相比，RUPP大鼠胎盘共有142个差异调控miRNA（40个上调、102个下调），下调前5位为miR-3587、miR-21-3p、miR-3556a、miR-29b-3p、miR-29a-3p，上调前5位为miR-6324、miR-6329、miR-628、miR-211-3p、miR-363-5p。利用TAM 2.0分析显示这些顶级失调miRNA参与免疫反应（miR-363、miR-21、miR-29）、B细胞分化（miR-628）、T细胞活化（miR-21）、脂肪生成与脂质代谢（miR-211、miR-29、miR-21）及血管生成（miR-363、miR-21）等与子痫前期相关的过程。手动检索发现RUPP大鼠与子痫前期患者共同一致上调的miRNA为miR-193a-3p、miR-224、miR-135、miR-301，共同下调的为miR-379-5p和miR-21；这些miRNA此前已被显示参与细胞模型中的滋养细胞侵袭、迁移及动物模型中子痫前期的发展。差异表达miRNA的GO富集分析显示，失调miRNA显著富集于解剖结构发育、程序性细胞死亡、凋亡和细胞死亡调控等生物学过程；细胞组分方面富集于细胞外基质、膜细胞器、蛋白复合物、胞质及细胞核；分子功能方面富集于激酶结合、细胞外基质成分、蛋白质二聚化和蛋白质结合；KEGG通路分析显示FoXO信号、细胞衰老和PI3K-Akt信号等显著富集，其中FoXO信号此前已被显示参与驱动滋养细胞凋亡和胎盘功能障碍。对差异表达miRNA的mRNA靶标进行GO富集分析显示，细胞间信号传导、Ca²⁺依赖性胞吐、对自然杀伤（NK）细胞介导毒性的易感性及对转化生长因子-β（TGF-β）刺激的反应等与子痫前期病理相关的重要生物学过程显著富集；细胞组分方面膜结合囊泡、网格蛋白包被囊泡、突触囊泡、细胞外基质和整合素复合物显著富集；分子功能方面蛋白复合物结合、神经营养酪氨酸蛋白激酶受体、肌动蛋白/肌球蛋白结合、细胞骨架、糖蛋白结合、氧化还原酶和单加氧酶活性富集。

讨论部分总结：本研究对RUPP子痫前期大鼠模型进行了全面的胎盘miRNA谱分析，发现miRNA失调与疾病发病机制相关的关键生物学过程相关。RUPP大鼠表现出平均动脉压显著升高和胎儿结局不良，证实了子痫前期表型。小RNA测序显示妊娠大鼠胎盘miRNA表达丰富，共检测到765个转录本；多数高表达和低表达（前10位）miRNA在对照与RUPP胎盘间共享，提示最丰富和最稀少miRNA表达在胎盘缺血下仍保留。仅在正常妊娠大鼠富集的miR-16-5p和miR-26a-5p在RUPP中下调；既往报道miR-16表达在小于胎龄儿相关胎盘中降低，提示胎盘缺血可能负面影响miR-16在胎胎盘单元的益处。差异表达分析鉴定142个失调miRNA且以下调为主，提示胎盘缺氧下miRNA生物合成或加工受损。顶级失调miRNA与免疫反应、B细胞分化、血管生成和脂质代谢相关；miR-628此前被报道在子痫前期患者胎盘中升高；与本研究一致，既往报道子痫前期患者胎盘miR-21表达降低并通过靶向RASA1促进子痫前期发展，胎盘miR-21降低也与小于胎龄儿相关，但也有报道子痫前期患者miR-21表达升高且通过hippo通路/PP2AB-beta和转录因子FOXM1介导滋养细胞侵袭。上调转录本中的miR-363此前被显示改变血管生成过程，近期研究报道小于胎龄儿相关人胎盘中miR-363表达高2.5倍。尽管RUPP大鼠未完全重现子痫前期患者的miRNA表达谱，少数miRNA一致上调（miR-193a、miR-224、miR-135、miR-301）和下调（miR-21、miR-379-5p）；miR-193b被显示通过与TGF-β的3′UTR结合降低滋养细胞迁移和侵袭；miR-379-5p是染色体14 microRNA簇（C14MC）成员，该簇此前被显示参与滋养细胞增殖、迁移和侵袭。总体提示胎盘缺血改变调控子痫前期发病机制的关键miRNA，尤其值得关注的是子痫前期中的免疫介导机制，本研究结果将miRNA失调归因于子痫前期免疫机制中的机制性作用。差异表达miRNA的GO分析进一步支持其在胎盘功能障碍中的作用；凋亡、程序性细胞死亡和解剖结构发育是显著富集的顶级生物学过程，与子痫前期中已知的滋养细胞功能障碍和胎盘细胞过度更新一致；预测靶标的广泛细胞定位提示miRNA失调可能影响胎盘内多个细胞区室；分子功能富集显示激酶结合、蛋白相互作用功能和细胞外基质结构，提示调控胎盘应激适应的关键信号网络；KEGG通路分析显示FoXO、PI3K-Akt信号和细胞衰老通路显著富集，这些通路与子痫前期胎盘功能障碍、氧化应激和内皮功能障碍相关。既往报道PI3K-Akt信号受损通过损害滋养细胞迁移、侵袭和血管生成在子痫前期病理中发挥重要作用；Akt活性缺失与sEng升高相关，而滋养细胞中PI3K-Akt激活与滋养细胞增殖、侵袭、MMP-2表达增加及模型中子痫前期特征改善相关。研究人员此前显示RUPP大鼠存在胎盘线粒体功能障碍和高活性氧（ROS）水平；miRNA此前被显示在包括子痫前期的多种病理中参与线粒体功能障碍和ROS生成，例如miR-210此前被显示引起原代滋养细胞线粒体功能障碍，但本研究中RUPP与对照大鼠miR-210表达无差异，这与既往报道RUPP大鼠胎盘缺血后miR-210表达无变化一致；然而，被显示增加线粒体ROS产生的miR-206在RUPP大鼠中上调；另一个在RUPP大鼠中下调的miR-21被显示抑制线粒体凋亡。尽管RUPP与子痫前期患者miRNA表达直接比较显示不一致，但多个转录本的总体差异确为子痫前期关键病理过程（包括胎盘线粒体功能障碍）的机制提供了线索。癌症相关通路也富集，提示驱动增殖、凋亡和代谢的共享调控机制。对差异表达miRNA的mRNA靶标进行GO富集分析，鉴定出与子痫前期病理直接相关的生物学过程，包括细胞间信号传导、钙依赖性胞吐、对NK细胞介导细胞毒性的易感性和对TGF-β的反应，提示改变的miRNA表达可能影响母胎免疫相互作用、囊泡运输和生长因子信号过程；研究还发现与膜结合囊泡、网格蛋白包被囊泡、突触囊泡样结构和细胞外基质成分的强关联，提示miRNA失调可能参与囊泡介导的信号通路（包括外泌体和细胞外囊泡运输），这些通路已被牵涉子痫前期病理；细胞骨架动力学、氧化还原酶活性和单加氧酶功能相关分子功能的富集进一步支持miRNA在调控氧化还原平衡、细胞结构和缺血代谢适应中的作用。局限性方面：RUPP模型虽重现子痫前期关键特征，但不涵盖人类疾病的完整临床异质性，因此RUPP大鼠与子痫前期患者miRNA转录本表达的直接比较可能不可靠，例如既往报道在子痫前期患者中上调的miR-210和miR-155，本研究中miR-210无变化而miR-155在RUPP大鼠中下调；顶级显著差异表达miRNA及其预测靶标未进行实验验证，因此这些发现应解释为基于测序的关联，未来需纳入qRT-PCR和miRNA-靶标相互作用的功能验证以确立其机制相关性；TAM 2.0主要依赖人类miRNA注释，其应用于大鼠RUPP模型应视为探索性，物种差异可能限制预测功能关联的直接转化；本研究未确定胎儿性别，因性别特异性效应不属于研究假设，新兴证据提示胎儿性别可能影响胎盘适应和子痫前期病理生理，因此本研究无法评估胎盘miRNA表达的潜在性别依赖差异，未来研究应考虑。总体而言，研究结果表明RUPP子痫前期模型中的胎盘缺血与miRNA异常表达相关，这些miRNA可能影响与子痫前期相关的免疫、血管生成、代谢和囊泡介导的信号通路；进一步研究miRNA介导的胎盘机制可能为胎盘功能障碍提供新见解，并有助于开发子痫前期的新型生物标志物或干预措施。研究结论译为：这些发现表明RUPP大鼠中显著的miRNA失调可能构成疾病发病机制的基础。