《Immunological Medicine》：Longitudinal changes in gut microbial evenness and dominance during anti-CD20-containing chemoimmunotherapy with concurrent trimethoprim–sulfamethoxazole prophylaxis in patients with B-cell lymphoma
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肠道微生物多样性降低与血液系统恶性肿瘤的不良预后相关。然而，淋巴瘤化学免疫治疗期间的纵向研究很少将丰富度（richness）与均匀度（evenness）加以区分。研究人员探讨了含抗CD20抗体的化学免疫治疗期间微生物多样性的变化是否反映检出分类群的丢失，抑或相
肠道微生物多样性降低与血液系统恶性肿瘤的不良预后相关。然而，淋巴瘤化学免疫治疗期间的纵向研究很少将丰富度（richness）与均匀度（evenness）加以区分。研究人员探讨了含抗CD20抗体的化学免疫治疗期间微生物多样性的变化是否反映检出分类群的丢失，抑或相对丰度的再分布。这项前瞻性、单中心探索性研究纳入40例B细胞淋巴瘤患者，收集其治疗前粪便样本，并获取18份配对治疗后样本。全部18名受试者从治疗开始至治疗后采样期间均接受甲氧苄啶-磺胺甲噁唑（trimethoprim-sulfamethoxazole，TMP-SMX）预防用药，且在两次采样之间及基线前3个月内未接受其他全身性抗菌药物暴露。经16S rRNA基因V3–V4区测序后，Pielou均匀度（Pielou's evenness，q=0.0077）与Shannon多样性指数（Shannon diversity，q=0.0208）在治疗后下降，而观测特征数（observed features）与Faith系统发育多样性（Faith's phylogenetic diversity）无显著变化（q分别为0.4923与0.7660）。优势度显著升高（Simpson优势度，q=0.0154；Berger–Parker指数，q=0.0237）。β多样性未显示可检测到的群落组成偏移，无属水平分类群达到差异丰度标准，且新优势分类群在不同个体间各异。上述变化伴随联合治疗暴露，该队列可能过度代表了临床稳定患者；化学免疫治疗与TMP-SMX的贡献无法分离。这些改变看似轻微且主要为结构性改变，最明确的变化体现在均匀度与优势度方面，而丰富度变化存在较大不确定性。
一、研究背景与问题
抗CD20抗体是多种B细胞淋巴瘤一线治疗的核心组成部分，如利妥昔单抗联合环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙（R-CHOP）方案已确立为弥漫大B细胞淋巴瘤的标准治疗逾二十年，苯达莫司汀联合利妥昔单抗则广泛用于惰性B细胞淋巴瘤。尽管这些治疗能提供持久的疾病控制并在侵袭性淋巴瘤中实现较高的治愈率，但同时诱导长期免疫抑制，包括B细胞耗竭、治疗相关淋巴细胞减少和低丙种球蛋白血症，这些状态常持续至治疗结束后数月，使感染成为治疗相关发病的主要原因之一。因此，识别影响化学免疫治疗后免疫恢复和临床结局的宿主及环境因素具有重要的临床意义。
肠道微生物群已成为黏膜和全身免疫的关键调节因子，通过短链脂肪酸等代谢物参与上皮屏障完整性、调节性T细胞稳态及炎症反应调节。在血液学领域，其临床相关性在移植和细胞治疗中最为明确：异基因造血细胞移植后肠道微生物多样性丧失和单一分类群优势化与血流感染及移植物抗宿主病相关，围植入期多样性降低与异基因及自体移植后死亡率增加相关。在CD19靶向嵌合抗原受体T细胞治疗中，输注前微生物组组成与治疗反应、生存和神经毒性相关，尽管这些关系可能受同时广谱抗菌药物暴露的混杂影响。
相比之下，B细胞淋巴瘤标准剂量化学免疫治疗期间肠道微生物组的纵向改变仍缺乏充分表征。既往横断面研究报道未经治疗的弥漫大B细胞淋巴瘤与健康对照存在组成差异，包括变形菌门和埃希氏菌-志贺氏菌属富集及产短链脂肪酸共生菌耗竭。Montassier等人在移植前清髓性预处理期间报道了28例非霍奇金淋巴瘤患者门水平的显著变化，预处理期间无伴随抗生素。Schmiester等人通过流式细胞术对12例侵袭性B细胞淋巴瘤患者观察到化学免疫治疗期间α多样性进行性下降随后恢复，且较低α多样性与预防性抗菌药物暴露相关。Sun等人分析41例接受R-CHOP的弥漫大B细胞淋巴瘤患者系列粪便样本，发现基线肠杆菌科丰度较高与后续细菌感染相关。这些研究在治疗强度、抗菌药物暴露和临床结局方面存在差异，限制直接比较。
Shannon多样性同时包含丰富度和均匀度，其降低可能反映分类群丢失、仍可检出分类群间相对丰度的再分布，或两者兼有；这些模式具有不同的生物学和临床意义，但很少被区分。此外，抗CD20抗体靶向参与黏膜免疫监视的细胞群体：利妥昔单抗耗竭结肠黏膜中CD20阳性B细胞，同时保留肠道驻留浆细胞。
二、研究目的与设计
这项探索性研究旨在检验抗CD20联合化学免疫治疗伴随的群落多样性降低是否反映丰富度丢失、持续分类群间相对丰度的再分布，或两者兼有，且无治疗性抗菌药物暴露。研究人员开展了一项前瞻性、单中心观察性研究，纳入即将启动抗CD20抗体治疗方案的B细胞淋巴瘤患者。基线前3个月内无受试者接受全身性抗菌治疗。治疗后采样仅限于除TMP-SMX预防用药外未接受其他全身性抗菌药物的患者，纵向队列中每位患者均从治疗首日起接受TMP-SMX预防并持续至治疗后采样时。由于化学免疫治疗与TMP-SMX预防在时间上完全重叠，两者统称为联合治疗暴露，观察到的变化不归因于任一单独组分。
三、主要技术方法
研究在日本大学板桥医院开展，于2023年8月至2024年9月前瞻性入组，临床随访至2026年6月30日数据截止。共纳入40例B细胞淋巴瘤患者提供基线粪便样本，其中18例提供配对治疗后样本。粪便样本使用TechnoSuruga Laboratory株式会社提供的采集保存管收集。DNA提取、PCR扩增、文库构建和测序由TechnoSuruga Laboratory株式会社按标准流程完成，16S rRNA基因V3–V4区采用通用引物Pro341F和Pro805R扩增，在Illumina MiSeq平台测序。序列处理使用QIIME 2版本2024.2，经DADA2去噪推断扩增子序列变异（ASV），基于SILVA 138参考数据库进行分类学分配。特征表以每样本7,000条读数进行不重复抽稀，基线58样本表和纵向36样本表独立抽稀。α多样性评估采用观测特征数、Shannon多样性、Pielou均匀度和Faith系统发育多样性，微生物优势度采用Berger–Parker指数和Simpson优势度。β多样性采用Bray–Curtis相异度和加权及未加权UniFrac距离，主坐标分析进行排序。属水平分析基于未抽稀ASV表聚合计数，采用Wilcoxon符号秩检验和ANCOM-BC2评估差异丰度。统计检验均为双侧，采用Benjamini–Hochberg校正。
四、研究结果
队列特征与基线肠道微生物组。 共58份粪便样本来自40例患者，其中18例同时提供治疗后样本，36份样本来自18例患者进行纵向分析。纵向队列包含15例弥漫大B细胞淋巴瘤、2例滤泡性淋巴瘤和1例脾边缘区淋巴瘤。治疗方案包括R-CHOP（7例）、泊洛妥珠单抗联合利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星和泼尼松龙（Pola-R-CHP；7例）、利妥昔单抗联合苯达莫司汀（3例）和奥滨尤妥珠单抗联合苯达莫司汀（1例）。两次采样间无患者接受除TMP-SMX外的全身性抗菌药物。纵向与非纵向队列在测量特征上无显著差异。基线分析中，弥漫大B细胞淋巴瘤（27例）、滤泡性淋巴瘤（8例）和其他B细胞淋巴瘤（5例）三组间α多样性和整体群落组成无显著差异。
治疗后群落均匀度下降、微生物优势度增加。 18例配对患者中，Pielou均匀度中位数从0.822降至0.746，16/18例下降（q=0.0077）；Shannon多样性从5.767降至5.094，15/18例下降（q=0.0208）。Berger–Parker指数中位数从0.1157升至0.1646，12/18例升高（q=0.0237）；Simpson优势度从0.0349升至0.0564，14/18例升高（q=0.0154）。相比之下，观测特征数（中位数128.5降至103.5，q=0.4923）和Faith系统发育多样性（11.882降至10.405，q=0.7660）无显著变化，置信区间跨越两个方向，丰富度变化方向和幅度存在较大不确定性。在14例接受蒽环类方案的患者亚组中，Pielou均匀度在13/14例中下降（p=0.0085）。三种深度相关敏感性分析均支持主要发现。
无检测到的整体群落偏移或稳健的属水平差异丰度。 以患者内限制排列的PERMANOVA未发现时间点间整体群落组成显著差异：治疗时间点解释Bray–Curtis相异度2.2%变异（q=0.448）、加权UniFrac距离2.6%（q=0.448）、未加权UniFrac距离3.6%（q=0.212）。PERMDISP亦未显示任何距离度量的多元离散度显著差异。属水平上，18例中12例优势属特征在时间点间发生改变，新优势分类群在不同患者间各异。优势属特征相对丰度中位数从治疗前20.9%升至治疗后25.9%，13/18例升高（p=0.0483），但从未超过50%。141个符合流行率阈值的属特征中，无特征在Wilcoxon分析或ANCOM-BC2分析中达到差异丰度标准。粪杆菌属在14/18例中下降，平均相对丰度从3.72%降至1.80%（名义p=0.0198，q=0.6148），但未通过多重检验校正。八属丁酸产生菌复合组无显著变化（10.56%降至8.89%，p=0.4683）。
淋巴细胞计数与感染事件的探索性分析。 绝对淋巴细胞计数变化与Pielou均匀度变化（ρ=0.172，p=0.494）或Shannon多样性变化（ρ=0.342，p=0.165）无显著相关，治疗后横断面相关性同样不显著。18例患者中1例在治疗后3个月内发生3级尿路感染，因事件数过少未进行感染状态比较。
五、讨论与结论
这项前瞻性观察性研究发现，接受抗CD20联合化学免疫治疗并同步TMP-SMX预防且无其他全身性抗菌药物暴露的B细胞淋巴瘤患者中，联合治疗暴露与肠道微生物均匀度一致降低和群落优势度相应增加相关。相比之下，观测特征数、Faith系统发育多样性和整体群落组成无显著变化，无属水平特征达到预设差异丰度标准。最明确的检出变化为均匀度降低和优势度增加，表明相对丰度向更不均匀、更优势化的群落再分布；丰富度变化则以较大不确定性估计。
Shannon多样性同时包含检出特征数及其相对分布，区分丰富度与均匀度对解释其降低至关重要。此处降低伴随Pielou均匀度降低和Berger–Parker及Simpson优势度升高，而观测特征丰富度无可检测变化。均匀度和优势度捕捉丰富度单独无法反映的群落结构方面；因其是同一丰度分布的数学相关度量，其一致变化应解释为共同结构改变的内部一致证据，而非同一发现的独立重复。该模式在重复抽稀和更高测序深度下持续存在，进一步支持其对所选抽稀程序的稳健性。从抽稀16S rRNA基因数据估计的丰富度仅反映在应用测序深度下高于检测限的分类群，观测特征数和Faith系统发育多样性无显著变化仅适用于该条件下可检测的丰富度，不排除低丰度分类群丢失。
与移植和强化治疗中报道的深度菌群失调相比，该改变幅度看似有限。本队列中Berger–Parker指数中位数从0.116升至0.165，优势属特征中位相对丰度从20.9%升至25.9%，仅在少数样本中超过30%优势化阈值且从未达到50%。治疗时间点仅解释β多样性变异的2.2–3.6%。尽管队列水平均匀度和优势度变化一致，其分类学表现因人而异：新优势分类群和最大增幅特征均未在队列中趋同，两种方法均无法识别稳健差异丰度的属水平特征。因此，纵向患者内结构指标可能比横断面分类群特征更好地捕捉治疗相关微生物组变化。
粪杆菌属在多数患者中下降，但未通过多重校正，应视为假设生成性发现。粪杆菌属普拉氏菌是丰富的产丁酸共生菌，具有抗炎和上皮支持特性，微生物丁酸促进结肠调节性T细胞分化。然而，先验丁酸产生菌复合组无显著变化，观察到的下降不能推广至整个产丁酸群落。属水平分类学分配无法确定检出物种或菌株的产丁酸能力，复合组仅为分类学替代指标，不测量通路丰度、基因表达或丁酸产生，功能后果需通过宏基因组、宏转录组或代谢组学测量验证。
观察到的结构变化机制无法从本研究确定。抗CD20抗体耗竭黏膜CD20阳性B细胞同时基本保留驻留抗体分泌浆细胞，但其效应无法与其他方案组分分离，细胞毒药物、皮质类固醇、治疗相关饮食和食欲变化及伴随用药均可能有所贡献。TMP-SMX预防是暴露的不可分割组分，也可能有所贡献。长期低剂量复方磺胺甲噁唑预防据报道产生有限的整体多样性变化但选择性分类学效应，然而这些数据来自其他人群和暴露背景，本队列中TMP-SMX贡献幅度无法量化。苯达莫司汀与延长淋巴细胞减少相关，但蒽环类亚组中均匀度降低持续存在，反对苯达莫司汀暴露为唯一解释。
观察到的变化临床相关性仍不确定。绝对淋巴细胞计数变化与Pielou均匀度或Shannon多样性变化无显著相关，但宽置信区间排除确切结论；仅1例3级感染事件无法评估均匀度降低或优势度增加是否与感染风险相关。鉴于小队列和有限事件数，本研究无法就观察到的微生物组变化与治疗反应、复发或生存的关联得出确切结论。
研究存在多项局限性。纵向队列小且来自单一机构，引入潜在选择偏倚。要求获得在计划访视且无间歇抗菌治疗的后治疗样本可能偏向临床稳定患者，限制对感染并发症或临床恶化患者的普适性。因伦理和临床约束需及时治疗，未设未经治疗的时间匹配淋巴瘤对照组，自发时间变异性、季节效应或生活方式改变的贡献无法完全排除。治疗方案异质，所有纵向评估患者均接受TMP-SMX预防且与化学免疫治疗完全重合，两者独立贡献无法估计。饮食摄入、排便习惯和粪便性状未系统记录。免疫学表征仅限于绝对淋巴细胞计数。16S rRNA基因测序提供有限的分类学和功能分辨率，治疗后样本仅采集一个时间点，变化持续时间和可逆性未知。
结论：在接受抗CD20联合化学免疫治疗的患者中，联合治疗暴露与肠道微生物均匀度降低和群落优势度增加相关。该模式在同步TMP-SMX预防且无其他全身性抗菌药物暴露下观察到，不伴随可检测的丰富度丢失或整体群落组成偏移。尽管分类学表现异质，该结构变化方向一致，指向检出分类群间相对丰度的再分布，但低丰度分类群同时丢失无法排除。与移植强化方案公开数据相比，该联合暴露伴随的肠道微生物变化看似更为有限。这些假设生成性发现支持在纵向研究中将均匀度和优势度与丰富度并列为评估指标。需在更大规模、多中心队列中复制，并设置适当对照组、详细暴露评估和功能分析，以确立其生物学和临床相关性。
