整合单细胞与批量RNA测序鉴定慢性阻塞性肺疾病离子通道相关生物标志物

《International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease》：Integrative Single-Cell and Bulk RNA Sequencing Analysis Identifies Ion Channel-Related Biomarkers in Chronic Obstructive Pulmonary Disease

　　

摘要 背景：人类离子通道基因（HICGs）作为跨膜信号转导的核心效应分子，在慢性阻塞性肺疾病（COPD）的发生与进展中发挥关键作用；然而，其潜在机制在很大程度上仍不清楚。本研究旨在探讨离子通道基因在COPD中的潜在价值。 方法：研究人员在COPD数据集中进行差异表达分析以筛选HICGs。采用107种机器学习模型鉴定核心HICGs并评估其诊断性能，并通过SHAP分析评估特征贡献。对核心HICGs进行基因集富集分析（GSEA）、免疫细胞浸润及炎症细胞因子相关性分析。利用一致性聚类和加权基因共表达网络分析（WGCNA）定义两种疾病亚型及关键模块。使用单细胞RNA测序数据检测核心HICGs的表达模式。随后进行虚拟敲除、虚拟药物筛选及分子对接。 结果：九个核心HICGs在跨数据集验证中表现出较高的诊断性能，其中LRRC8D在SHAP分析中排名第一。这些HICGs与免疫细胞及炎症细胞因子显著相关。一致性聚类显示两种亚型之间存在显著的性别差异（BH校正P = 0.01），且两种亚型分别富集于吞噬作用及MAPK信号通路。利用Ro/e指数的单细胞RNA测序分析提示疾病组中巨噬细胞富集而平滑肌细胞减少。LRRC8D的虚拟敲除被预测优先影响CD68，且受影响基因富集于人巨细胞病毒感染通路。虚拟筛选将Tezacaftor列为潜在治疗药物，分子对接预测Tezacaftor可能对核心HICGs表现出高结合亲和力。 结论：研究人员鉴定了COPD中潜在的HICGs，并提示LRRC8D的潜在作用，以及核心HICGs在疾病亚型分型中的潜在应用价值，尤其是在性别方面；Tezacaftor可能作为候选治疗药物。

慢性阻塞性肺疾病离子通道相关生物标志物的整合性鉴定：从多组学分析到药物预测

一、研究背景与科学问题

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是以持续性气流受限为特征的慢性呼吸系统疾病，是全球第三大死亡原因。根据2023年全球疾病负担（GBD）研究，2023年全球约有2.146亿人罹患COPD，年龄标准化患病率为每10万人2373.0例，占慢性呼吸系统疾病死亡总数的82.3%。然而，高达70%的COPD病例未被诊断。COPD的发病机制涉及氧化应激、炎症反应、免疫失调及环境暴露等多重因素。

离子通道是控制特定离子跨膜流动的跨膜蛋白，通过开放与关闭实现电信号传导，在神经传导、肌肉收缩及细胞信号转导中发挥重要作用。近年证据表明，离子通道功能障碍参与COPD的发生发展，尤其是气道上皮细胞的离子转运异常。囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）氯通道功能受损会破坏气道表面液体稳态、损害黏液纤毛清除、促进病原体定植并诱导炎症；上皮钠通道（ENaC）过度活跃与肺气肿及肺功能下降相关；瞬时受体电位（TRP）通道尤其是TRPA1已成为COPD气道重塑的潜在治疗靶点；钠钙交换体1（NCX1）在COPD患者中性粒细胞中表达升高，香烟烟雾增强其活性并促进中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成。

LRRC8D编码容积调节性阴离子通道（VRAC）的非必需亚基，与成孔亚基LRRC8A组装共同调节细胞体积稳态。VRAC异聚体包含LRRC8D时可抑制2′3′-环状GMP-AMP（cGAMP）的跨膜转运，从而调节cGAS–STING介导的固有免疫及抗病毒反应。转录组学证据表明LRRC8D在病变气道上皮中表达失调，是COPD中下调微小RNA的高度连接靶基因，并与氧化型IL-33处理的气道上皮中杯状/分泌细胞标志物TFF3共上调。

尽管已有上述报道，LRRC8D及其他离子通道基因在COPD中的细胞类型分布、免疫微环境关联、诊断价值及治疗潜力仍 largely 未知。研究人员假设LRRC8D及其他核心HICGs在COPD中表达失调，参与疾病通路及免疫失调，并可能作为诊断生物标志物、亚型决定因素及治疗靶点。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员从基因表达综合数据库（GEO）获取五个COPD表达数据集（GSE76925、GSE20257、GSE106986、GSE38974、GSE8545）及一个单细胞数据集（GSE173896）。GSE76925与GSE20257合并作为发现队列（134例COPD、152例对照），三个独立数据集作为外部验证队列。研究采用的技术方法主要包括：

1. 1.
   差异表达分析筛选COPD相关HICGs，并通过基因-基因相互作用（GGI）网络及基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）、Reactome、疾病本体（DO）、ImmPort基因集富集分析进行功能注释；
2. 2.
   整合11种机器学习算法（Stepglm、LDA、XGBoost、朴素贝叶斯、SVM、RF、glmBoost、LASSO、plsRglm、Ridge、Enet）构建107种模型鉴定核心HICGs并评估诊断性能，采用SHAP分析进行特征归因与模型解释；
3. 3.
   单基因基因集富集分析（GSEA）探索核心HICGs相关通路；
4. 4.
   CIBERSORT与MCP-counter算法评估免疫细胞浸润及免疫丰度，并分析24种炎症细胞因子相关性；
5. 5.
   一致性聚类定义分子亚型，加权基因共表达网络分析（WGCNA）筛选亚型相关模块；
6. 6.
   单细胞RNA测序数据分析细胞类型特异性表达，Ro/e指数比较疾病组与对照组细胞亚群富集差异，scTenifoldKnk进行LRRC8D虚拟敲除；
7. 7.
   DrugReflector框架进行药物重定位虚拟筛选，PyRx与Vina 2.0进行分子对接。

三、主要研究结果

1. COPD相关HICGs的鉴定与富集分析

发现队列中疾病组离子通道通路活性显著上调。共鉴定1525个COPD相关差异表达基因（DEGs），与HICG集交集获得13个相关HICGs（10个上调、3个下调）。GGI网络分析突出核心HICGs周围的关键转录因子，功能富集显示显著参与"门控通道活性"、"配体门控阳离子通道活性"等分子功能。GO分析富集于"钙离子跨膜转运"、"单价离子通道复合物"及"单价离子通道活性"，KEGG通路分析强调"钙信号通路"，Reactome分析指向"中性粒细胞脱颗粒"等免疫相关通路。

2. 机器学习鉴定核心HICGs及诊断模型构建

107种机器学习模型中，LASSO + RF算法效率与准确性最佳，形成9基因诊断模型（GJB2、CHRNA1、LRRC8D、CATSPERB、TRPM7、VDAC3、KCND3、TPCN1、SCN4B），在发现队列及三个验证队列中AUC介于0.729至0.999之间。LRRC8D与VDAC3在各队列中AUC持续高于0.7，支持其作为稳定诊断生物标志物的潜力。基于列线图的校准曲线显示预测与实际风险高度一致，决策曲线分析（DCA）表明列线图较单个基因提供更大净收益。相关性分析发现LRRC8D与VDAC3正相关，TRPM7与VDAC3负相关。

3. SHAP特征归因与模型解释

八种诊断模型中C5.0表现最佳（AUC = 0.803）。SHAP分析量化基因贡献，鉴定LRRC8D与CATSPERB为关键因素。SHAP蜂群图与依赖图显示基因表达与SHAP值之间存在非线性关系。单样本力场图与瀑布图分析表明，疾病风险预测可能依赖于多个基因表达的平衡与组合。

4. 核心HICGs的GSEA

单基因KEGG GSEA显示各核心HICGs富集通路的功能多样性。LRRC8D与抗坏血酸和醛酸代谢、轴突导向及造血细胞谱系相关；TPCN1富集于钙信号通路、原发性免疫缺陷及T细胞受体信号通路；TRPM7与TGF-β信号通路、基础转录因子及造血细胞谱系相关。钙信号通路在SCN4B与TPCN1中一致富集，提示钙信号通路可能是这些离子通道基因的共同通路。

5. 核心HICGs与免疫微环境的相关性

CIBERSORT分析显示LRRC8D与静息树突状细胞正相关，TPCN1与活化树突状细胞及中性粒细胞负相关，TRPM7与嗜酸性粒细胞正相关。MCP-counter分析显示CHRNA1、LRRC8D、SCN4B与单核细胞相关，GJB2与B谱系及内皮细胞相关，TRPM7与T细胞负相关。细胞因子水平上，LRRC8D与VDAC3与多种炎症细胞因子显著相关。

6. 无监督聚类比较临床与免疫学特征

一致性聚类在k = 2时鉴定两种分子亚型C1（n = 69）与C2（n = 65）。CHRNA1、GJB2、LRRC8D、TPCN1在亚型间显著差异表达。临床特征比较显示C1亚型女性比例显著高于C2（BH校正P = 0.01），C2亚型倾向于年龄更大、吸烟包年数更多。免疫微环境分析显示C1亚型具有更高水平的T细胞、CD8? T细胞、细胞毒性淋巴细胞、B细胞、单核细胞及髓样树突状细胞，且CD4与HLA-DRA表达升高。

7. WGCNA筛选分子亚型相关核心模块

WGCNA鉴定10个稳定模块，品红模块与C1亚型强相关，绿黄色模块与C2亚型相关。品红模块的GO富集包括免疫效应过程调控、质膜外侧及免疫受体活性，KEGG通路以吞噬作用为首；绿黄色模块的GO富集包括区域化、顶端质膜及单价阴离子跨膜转运蛋白活性，KEGG通路以MAPK信号通路为首。

8. 单细胞分析与虚拟敲除

单细胞转录组分析鉴定19个聚类，归为8种细胞类型：B细胞、T细胞、内皮细胞、上皮细胞、巨噬细胞、单核细胞、NK细胞及平滑肌细胞。疾病组巨噬细胞增多、平滑肌细胞减少。核心HICGs在巨噬细胞中显示最高特征活性。LRRC8D、TRPM7、VDAC3在巨噬细胞中高表达，TPCN1与SCN4B在平滑肌细胞中高表达，TRPM7在上皮细胞中高表达。Ro/e分析证实疾病组巨噬细胞富集、平滑肌细胞减少。LRRC8D虚拟敲除被预测影响CD68、HLA-DRA等基因，KEGG富集突出人巨细胞病毒感染、脂质与动脉粥样硬化及卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染等通路。

9. 虚拟筛选与分子对接

基于DrugReflector logit评分，BRD-K97101532（Tezacaftor，PubChem CID：46199646，C₂₆H₂₇F₃N₂O₆）获得最高评分。分子对接分析显示该化合物对所有九个核心HICGs的结合亲和力均低于?5.0 kcal/mol，其中七个低于?7.0 kcal/mol。CATSPERB具有最低结合亲和力（?8.9 kcal/mol），提示Tezacaftor可能值得作为候选治疗药物进一步研究。

四、讨论与结论

研究人员指出，本研究独特地结合生物信息学、机器学习、SHAP分析、单细胞虚拟扰动、基于药物重定位的虚拟筛选及分子对接，鉴定COPD离子通道相关诊断生物标志物及候选治疗化合物。核心HICGs中，LRRC8D作为VRAC底物特异性关键亚基，参与有机渗透物质转运、氧化应激反应及炎症信号调控；在巨噬细胞中，渗透敏感性LRRC8阴离子通道的激活是NLRP3炎症小体活化及IL-1β产生所必需的。TRPM7在香烟烟雾暴露大鼠气道平滑肌细胞中表达显著上调，促进细胞增殖及IL-8分泌。CHRNA1被生物信息学分析鉴定为COPD核心基因，CHRNA基因rs1051730多态性被鉴定为COPD易感变异。

研究人员强调，直接从转录组数据集获得的证据（核心HICGs、分子亚型及诊断模型）应与虚拟敲除、虚拟筛选及分子对接产生的计算预测区分开来，后者属于假设生成性质，需要实验验证。

本研究存在若干局限性：分析完全依赖公共数据库的回顾性数据，缺乏细胞、动物及临床水平的系统验证；分子亚型及临床特征关联尚未在大规模前瞻性临床队列中验证；未进行敏感性分析评估结果稳健性；虚拟敲除及分子对接结果属于计算预测，可能受数据集特定效应、计算假设、参数选择及不完整多重检验校正影响，可能包含假阳性。

研究结论：本研究鉴定了与COPD相关的若干HICGs，尤其是LRRC8D、VDAC3及CHRNA1，SHAP分析提示LRRC8D的潜在作用。虚拟筛选预测Tezacaftor为有前景的治疗候选药物。单细胞分析提示COPD患者巨噬细胞增多、平滑肌细胞减少。这些发现属于假设生成性质，需要独立实验确认。未来研究应优先进行系统验证，以推动研究成果向临床实践转化。