《International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease》：Identification of Five Candidate Genes and Development of an Exploratory Diagnostic Nomogram for COPD Using Integrative Single-Cell and Bulk Transcriptomic Analyses
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背景：整合性转录组分析可优先筛选与慢性阻塞性肺疾病（COPD）相关的基因，但表达关联仍需实验评估。
方法：研究人员分析了单细胞GSE173896和批量GSE57148数据，采用聚类、共表达网络、CellChat、差异表达、免疫反卷积、拟时序及虚拟敲除分析。在G
背景：整合性转录组分析可优先筛选与慢性阻塞性肺疾病（COPD）相关的基因，但表达关联仍需实验评估。
方法：研究人员分析了单细胞GSE173896和批量GSE57148数据，采用聚类、共表达网络、CellChat、差异表达、免疫反卷积、拟时序及虚拟敲除分析。在GSE57148中构建了五基因logistic列线图。临床RT-qPCR纳入30例COPD患者和30例非COPD对照。在HBEC3-KT和BEAS-2B细胞中，利用两种独立的IL6靶向siRNA，通过上皮-巨噬细胞共培养、细胞因子检测及划痕愈合实验进行评估。
结果：NHSL2、CDKL5、CRIP1、TNNI2和IL6被优先筛选为候选基因。临床RT-qPCR支持COPD中CDKL5、IL6和NHSL2表达升高，CRIP1和TNNI2表达降低。IL6敲低降低了上皮细胞IL6表达，并在上皮细胞经香烟烟雾提取物（CSE）暴露后的共培养中减弱了多种巨噬细胞相关转录反应。分泌反应因细胞系和siRNA而异；共培养IL-10的降低在HBEC3-KT系统中显著，但在BEAS-2B系统中不显著。IL6敲低还降低了上皮划痕愈合率。列线图仅在其开发队列内进行了评估，缺乏独立外部验证。
结论：该研究鉴定了五个COPD相关候选基因，并提供了上皮IL6扰动与特定共培养反应及划痕愈合相关联的实验证据。这些发现并未确立COPD特异性机制或治疗获益。该列线图仍属探索性工具，需独立验证。
整合单细胞与批量转录组分析鉴定慢性阻塞性肺疾病候选基因及探索性诊断列线图的构建
研究背景与科学问题
慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以持续气流受限和肺功能进行性下降为特征的慢性呼吸系统疾病，已成为全球发病率和死亡率的主要原因之一。COPD的发病并非源于单一病理过程，而是气道、肺实质和肺血管在长期暴露于有害颗粒或气体后共同受累的复杂重塑过程。持续性慢性炎症、组织修复异常、免疫失衡和细胞外基质重塑被认为是疾病进展的主要生物学驱动因素。然而，尽管对COPD发病机制的认识已取得显著进展，其分子异质性和细胞生态系统仍未得到充分定义，这限制了早期诊断策略和精准干预措施的发展。
巨噬细胞参与肺宿主防御、组织稳态和损伤反应，但其转录和功能状态具有高度异质性。在COPD中，抗原加工、吞噬、炎症反应和代谢适应的变异可能共存于同一组织中，传统的M1/M2二元分类无法完全描述这种多样性。单细胞分析为研究这些状态提供了途径，而批量表达则捕捉了同样依赖于细胞组成的组织水平信号。
已有研究如COPDGene和SPIROMICS通过详细的临床、生理、影像和生物学表征来研究疾病异质性；Fangal等结合生理、血液转录组和影像测量来区分哮喘、COPD及哮喘-COPD重叠的特征；Sauler等描述了COPD肺泡微环境中的上皮应激异常和巨噬细胞异质性；Zhang等利用单核及多模态分析将异常细胞状态和细胞群落与临床异质性相关联。这些研究为研究COPD中免疫和结构细胞变化奠定了重要基础。
在此背景下，研究人员整合批量差异表达与选定的批量及单细胞共表达基因集，以优先筛选COPD相关候选基因并表征其细胞和网络关联。在扩大的临床队列（30例COPD和30例非COPD）中评估候选基因表达。为超越表达水平的评估，研究人员选择IL6在两种气道上皮细胞系中进行实验扰动，并检查上皮-巨噬细胞共培养和上皮划痕愈合中的反应。CellChat、拟时序和虚拟敲除分析仍属假设生成性组件。探索性列线图用于描述批量队列内的区分能力，其临床适用性留待独立验证。
主要关键技术方法
研究人员从基因表达综合数据库（GEO）获取公共转录组数据。单细胞分析使用GSE173896的子集，包含10份肺样本：5份来自COPD参与者，5份来自非COPD参与者（其中后者包括3名不吸烟者）；批量转录组开发队列GSE57148包含98例COPD和91例肺功能正常的对照。主要方法包括：使用Seurat处理单细胞数据并进行无监督聚类和基于标志物的细胞注释；使用CellChat推断细胞间通讯；使用hdWGCNA进行单细胞共表达网络分析；使用Monocle2对巨噬细胞进行拟时序分析；使用WGCNA进行批量共表达网络分析；使用CIBERSORT进行免疫反卷积；使用limma进行批量差异表达分析；使用scTenifoldKnk进行虚拟敲除分析；临床RT-qPCR验证来自天津胸科医院手术标本的30例COPD和30例非COPD肺组织样本；在HBEC3-KT和BEAS-2B细胞系中进行IL6 siRNA敲低实验，结合THP-1来源巨噬细胞的间接共培养、细胞因子ELISA检测和划痕愈合实验。
研究结果
分析肺样本的细胞组成
单细胞UMAP显示多个转录上不同的群体，基于标志物的注释鉴定出11种主要细胞类型。COPD和对照细胞在广泛的细胞群体内重叠，但其分布和相对比例存在差异。代表性表达模式包括上皮群体中的EPCAM和CDH1、B细胞中的CD79A、巨噬细胞中的CD68、NK细胞群体中的NKG7、肥大细胞中的KIT、成纤维细胞中的DCN、内皮细胞中的PECAM1和增殖细胞中的MKI67。细胞类型比例在个体样本和汇总疾病组之间均有变化。
预测的细胞间通讯
CellChat在COPD中推断出3748个相互作用，在对照中推断出3681个，聚合通讯强度值分别为76.266和72.251。通路水平的信息流在组间存在差异，配体-受体图包括HLA相关相互作用、涉及ICAM1、PECAM1和CD99的黏附相关配对，以及涉及FN1、胶原蛋白和层粘连蛋白的细胞外基质相关配对。一些预测的相互作用在COPD中较高，另一些在对照中较高。
单细胞共表达模块和富集模式
hdWGCNA鉴定了多个共表达模块，具有不同的代表性hub基因和特征基因分布。基因集富集图突出显示了抗原加工和呈递、MHC蛋白复合物结合、肽结合、溶酶体和囊泡区室、吞噬体和胆固醇代谢。这些注释为研究分析肺数据中的免疫和吞噬溶酶体程序提供了基础。
批量免疫估计和模块-性状关联
CIBERSORT估计了COPD和对照样本中异质的免疫细胞分数，包括巨噬细胞、T细胞、单核细胞和肥大细胞类别。批量WGCNA鉴定了多个共表达模块。蓝色模块与估计的M2分数呈正相关（r = 0.38，P = 1×10?7），与组变量呈负相关（r = ?0.54，P = 2×10?15）。红色模块与组变量呈正相关（r = 0.58，P = 9×10?18），与M2估计呈负相关（r = ?0.31，P = 3×10?5）。turquoise模块与M2估计呈正相关（r = 0.24，P = 0.001），而黄色和绿色模块与组变量呈正相关。
候选基因和探索性列线图
差异表达和选定共表达基因集的交集产生了NHSL2、CDKL5、CRIP1、TNNI2和IL6。在GSE57148中，单基因AUC分别为NHSL2 0.836、CDKL5 0.787、CRIP1 0.738、TNNI2 0.707和IL6 0.619。在同一队列中构建了五基因logistic回归列线图。决策曲线在部分阈值范围内显示高于参考策略的估计净获益，校准图比较了开发数据内的预测和观察概率。
批量队列和临床肺组织中的表达模式
扩大的临床队列包括30例COPD和30例非COPD参与者，平均年龄分别为63.1 ± 8.7和63.2 ± 8.6岁，每组各24名（80.0%）男性。每组包括6名从不吸烟者、12名当前吸烟者和12名既往吸烟者。两组的平均吸烟暴露量均为25.4 ± 16.7包年。支气管扩张剂后FEV1/FVC在COPD组为0.53 ± 0.10，非COPD组为0.82 ± 0.04；FEV1分别为预测值的59.5 ± 20.3%和95.6 ± 7.3%。在GSE57148中，CDKL5、IL6和NHSL2在COPD中表达较高，而CRIP1和TNNI2表达较低。临床肺组织RT-qPCR在30例COPD和30例非COPD参与者中显示了相同方向的表达差异。
细胞表达、免疫关联和基因组位置
在单细胞图中，CDKL5表达在上皮群体中更为明显，而CRIP1在包括巨噬细胞、树突状细胞和增殖细胞在内的多个群体中被检测到。TNNI2表达在巨噬细胞注释和增殖群体中观察到。NHSL2和IL6检测稀疏，限制了细胞类型特异性的可靠分配。免疫关联热图显示候选基因的不同相关模式。基因组定位将CDKL5和NHSL2置于X染色体上，其余基因位于其他染色体上。
探索性巨噬细胞重聚类
巨噬细胞重聚类包含2378个细胞，鉴定出四个具有不同表达模式的亚簇。相关注释包括免疫细胞活化和分化、趋化、炎症反应、翻译、黏附和代谢过程。
拟时序相关转录模式
Monocle2沿分支轨迹排列巨噬细胞注释细胞，亚簇分布在多个推断状态中。拟时序热图包含表达增加、减少和早期富集的基因组。CRIP1显示非单调模式，在推断轨迹的中后段拟合表达较高。TNNI2早期表达较高，随后呈较低且相对稳定的模式。CDKL5和NHSL2检测稀疏，拟合趋势变化不大。IL6保持低水平，未显示持续升高。
虚拟敲除后的预测网络扰动
scTenifoldKnk为CDKL5、CRIP1、IL6、NHSL2和TNNI2产生了不同的预测网络扰动基因集。CDKL5的富集注释包括肺和呼吸系统发育、表面活性物质稳态、细胞-基质连接、黏着斑和细胞外基质。CRIP1的注释包括抗原加工和呈递、肽和MHC结合、吞噬体和溶酶体相关程序。IL6相关扰动包括体液免疫反应和囊泡、内体及免疫加工注释。NHSL2扰动基因集富集于微管束形成、纤毛运动和微管相关运动。TNNI2扰动集包括白细胞活化、脱颗粒、免疫受体信号传导和吞噬体相关注释。
上皮IL6敲低的实验评估
实验设计结合了上皮IL6扰动与THP-1来源巨噬细胞的间接共培养。两种si-IL6均降低了HBEC3-KT和BEAS-2B细胞中相对于si-NC的IL6 mRNA。在CSE实验中，CSE + si-NC组的上皮IL6表达高于Control组，两种IL6靶向siRNA在每个细胞系中均降低了这种表达。巨噬细胞CD163和MRC1转录本在与CSE暴露的si-NC上皮细胞共培养后高于Control条件，两种上皮IL6靶向siRNA均降低了这些转录本。巨噬细胞IL10反应不太一致：两种siRNA在HBEC3-KT共培养系统中均降低了IL10，而在BEAS-2B系统中仅si-IL6-2达到统计学显著性。上皮细胞单独的IL-6浓度在CSE + si-NC条件下增加，两种IL6靶向siRNA均降低了BEAS-2B上清液中的IL-6浓度，在HBEC3-KT上清液中仅si-IL6-2达到显著。IL-10浓度在CSE + si-NC共培养上清液中高于Control上清液，两种IL6靶向siRNA在HBEC3-KT系统中均显著降低了共培养IL-10，而在BEAS-2B系统中均未达到统计学显著性。在划痕愈合实验中，两种IL6靶向siRNA在HBEC3-KT和BEAS-2B细胞中均与24小时时较si-NC更低的划痕闭合相关。
讨论与结论
该研究通过整合组织水平表达与单细胞和批量共表达分析，优先筛选了五个COPD相关候选基因。扩大的60名参与者临床队列支持其表达差异方向，新实验将上皮IL6扰动与选定的巨噬细胞相关转录本、细胞因子测量和上皮划痕愈合联系起来。计算整合本身是已有方法，新增贡献在于候选基因集和跨两种上皮细胞系统对一个候选基因的实验评估，而非发现新的通用COPD机制。
抗原呈递、吞噬溶酶体和脂质相关注释与先前COPD巨噬细胞研究大体一致，但富集不能区分有效宿主防御反应与代偿性转录、细胞组成改变或功能障碍性激活。黏附和细胞外基质注释符合肺损伤和重塑的文献，但当前比较未确立COPD特异性，研究未纳入哮喘、哮喘-COPD重叠、特发性肺纤维化或病毒性肺损伤等疾病对照组。
CellChat估计的是潜在通讯的配体-受体对兼容性，新共培养实验显示扰动上皮IL6伴随选定巨噬细胞读数变化，但不验证完整CellChat网络或确立空间接触。巨噬细胞亚簇和转录程序不能自动映射到经典M1/M2类别，CIBERSORT M2分数是源自批量组织的参考签名估计。
五个候选基因的证据强度不均。IL6因其已确立的炎症相关性和上皮-免疫背景被选为实验评估对象，其与COPD的关联并非新发现。CRIP1在免疫及其他群体中的表达和抗原呈递相关虚拟扰动注释提供了研究依据。CDKL5在神经元系统中的激酶活性与微管相关底物相关，提供有限依据。NHSL2主要证据来自批量表达发现，稀疏单细胞检测和纤毛/微管相关注释不确立巨噬细胞调节作用。TNNI2需独立确认其细胞来源和蛋白表达。
IL6实验使用两种独立siRNA在两种上皮细胞系中提供了趋同证据，表明降低上皮IL6可改变所测量的共培养和划痕闭合反应。巨噬细胞CD163和MRC1表达降低在两种共培养系统中均观察到，而IL10转录和细胞因子分泌一致性较低。划痕闭合的方向也值得注意：IL6敲低降低了闭合而非改善。这些实验不确立IL-6通过特定受体通路直接极化肺巨噬细胞，CD163、MRC1和IL10是有限标志物组，THP-1来源巨噬细胞不能完全再现原代肺巨噬细胞的多样性。
五基因列线图仍是在GSE57148中开发和评估的概念验证模型，候选选择与性能评估在同一队列中进行可能产生乐观估计。校准和决策曲线不能替代在独立参与者中对固定模型的评估。扩大的30对30临床组织队列加强了表达水平评估，但未在该队列中评估拟合模型的预测。临床转化需明确预期使用人群、独立评估区分度和校准度，以及证明超越既有临床信息的附加价值。
研究存在多项局限性：单细胞子集仅包含5例COPD和5例非COPD供者；临床表达队列虽扩至60名参与者但仍为单中心手术组织系列；转录组分析均为观察性；仅IL6接受了实验扰动评估，实验使用两种上皮细胞系和THP-1来源巨噬细胞，独立实验次数有限，未包含拯救实验、受体阻断、原代细胞重复或体内验证；未纳入其他炎症性肺病作为比较组，COPD特异性仍未检验；拟合列线图缺乏独立外部验证。
结论：整合单细胞和批量转录组分析优先筛选了NHSL2、CDKL5、CRIP1、TNNI2和IL6作为COPD相关候选基因，并支持开发探索性列线图。30例COPD和30例非COPD肺样本的临床RT-qPCR支持表达差异。上皮IL6敲低改变了共培养中选定的巨噬细胞相关反应并降低了上皮划痕愈合，为一种候选基因在限定体外条件下提供了实验证据。这些发现不确立所有五个基因的功能、COPD特异性机制或治疗获益。列线图在考虑临床使用前需独立外部验证。
