异养原生动物Aurantiochytrium（Labyrinthulomycetes）作为赤潮藻Heterosigma akashiwo裂解后病毒诱导溶解有机物关键消费者的生态作用

《Microbiology Spectrum》：Ecological role of the heterotrophic protist Aurantiochytrium (Labyrinthulomycetes) as a key consumer of viral-induced dissolved organic matter following the lysis of the red tide-forming microalga Heterosigma akashiwo

　　

海洋藻华在海洋碳循环中发挥重要作用。然而，藻华因病毒感染而崩溃后所释放有机物的生态学后果尚不清楚。近期研究表明，病毒感染显著改变宿主的胞内代谢物组成，且由此产生的病毒裂解物可选择性地促进特定原核生物种群的生长。本研究旨在阐明源自健康及病毒感染的形成藻华的微藻Heterosigma akashiwo细胞的有机物对异养真核生物（特别是Labyrinthulomycetes）生长的影响。这些海洋原生动物主要为腐生或捕食性，参与溶解有机物（DOM）分解和营养循环。在大阪湾开展的为期12个月的现场监测显示，尽管Labyrinthulomycetes群落整体未表现出明显的季节性，但这些原生动物的特定种群与Heterosigma akashiwo共现。为从机制上探究现场观测所提示的潜在营养联系，研究人员建立了包含H. akashiwo、其特异性病毒（HaV53）以及作为模型Labyrinthulomycetes的Aurantiochytrium sp. NBRC102614的共培养体系。在共培养实验中，H. akashiwo的病毒裂解导致Aurantiochytrium sp.细胞密度显著增加，表明Aurantiochytrium能够利用源自病毒感染藻类的底物（包括病毒诱导溶解有机物（vDOM））而增殖。这些发现凸显了异养Labyrinthulomycetes是病毒修饰有机物的关键消费者，在有害藻华崩溃后的碳循环中发挥关键作用，并影响沿岸微生物食物网内的碳传递。重要性：海洋生态系统由微藻、病毒和异养真核生物之间的相互作用所塑造，尽管异养原生动物的生态作用仍知之甚少。本研究调查了海洋微藻与异养真核生物（即Heterosigma物种和Labyrinthulomycetes）的动力学，并检验了Heterosigma akashiwo的病毒感染对Aurantiochytrium物种（异养Labyrinthulomycetes的成员）生长和增殖的影响。研究结果揭示了若干与Heterosigma种群相关的Labyrinthulomycetes的动力学，并提示Aurantiochytrium物种可通过利用Heterosigma藻华因病毒感染终止期间释放的vDOM来重新分配碳。这些发现还将Aurantiochytrium从被动的异养组分重新定位为与Heterosigma病毒感染相关的主动生态因子，从而影响微藻群落动力学。总体而言，本研究为沿岸海洋系统中病毒感染Heterosigma的归宿提供了新见解，该过程由异养Labyrinthulomycetes（特别是Aurantiochytrium物种）介导，从而填补了微生物生态学中的重要知识空白。

**研究背景与科学问题**

微藻驱动的海洋光合生产力通过碳固定构成海洋食物链的基础。此外，源自微藻的溶解有机物（dissolved organic matter，DOM）被异养微生物利用，后者通过将这些有机物质重新整合入食物网来塑造海洋生态系统。然而，多种微藻属（如*Gonyaulax*、*Pseudo-nitzschia*、*Chaetoceros*、*Prymnesium*、*Chattonella*、*Heterosigma*）被报道可形成有害藻华（harmful algal blooms，HABs），威胁水生动物和人类，造成严重经济损失。藻华不会无限持续，病毒感染和异养真核微生物的捕食被认为是加速其终止过程的关键因素。病毒主要通过病毒分流（viral shunt）和病毒穿梭（viral shuttle）两种机制影响碳流，其影响受宿主特异性严格调控。病毒可通过操纵宿主代谢增强病毒粒子产生，导致感染细胞释放的病毒诱导溶解有机物（virus-induced dissolved organic matter，vDOM）组成及代谢物组成的显著变化。*H. akashiwo*藻华至少部分受特异性双链DNA病毒*Heterosigma akashiwo* virus（HaV）调控。除病毒外，作为微生物环关键组分的异养真核微生物通过捕食活动在终止微藻藻华中发挥重要作用。Labyrinthulomycetes可通过其外质网系统捕食微藻，并通过产生胞外酶参与有机物降解。然而，Labyrinthulomycetes能否通过捕食特异性利用*H. akashiwo*仍不清楚。迄今，现场观测提示Labyrinthulomycetes与浮游植物动力学之间存在联系，但支配其相互作用的机制（尤其在藻华崩溃事件后）仍知之甚少。在*H. akashiwo*藻华后曾观察到感染Aurantiochytrium物种的病毒AuRNAV增加，提示其宿主丰度可能增加。虽然病毒裂解物对原核生物群落的选择性刺激已被阐明，但异养真核生物对这种改变的vDOM输入的反应仍不清楚。因此，本研究将现场观测与受控实验室实验相结合，以填补这一空白。

**主要技术方法**

研究人员在大阪湾沿岸站点（34°19′28″N，135°7′15″E，水深5 m、距海底1.8 m的取水口）开展12个月（2022年1—12月）月度采样，采集颗粒态（particle-associated，PA）组分，提取DNA后进行18S rRNA基因V8–V9区扩增子测序（MiSeq平台），基于SILVA 138数据库进行物种注释，利用Pearson相关系数开展共现分析，并用冗余分析（redundancy analysis，RDA）评估温度、盐度、SiO?的影响。研究材料方面，赤潮微藻*H. akashiwo* H93616及其病毒HaV53分离自日本广岛湾，异养真核生物*Aurantiochytrium* sp. NBRC102614分离自日本神户沿岸。研究人员建立了分别靶向*H. akashiwo* β-tubulin基因和HaV53 mcp基因的定量PCR（quantitative PCR，qPCR）方法，并构建了包含*H. akashiwo*、HaV53与*Aurantiochytrium*的三元共培养体系，细胞计数采用流式细胞仪和血球计数板，组间差异采用Mann–Whitney U检验。

**研究结果**

*大阪湾Labyrinthulomycetes的真核生物月度动力学*：基于18S rRNA基因测序的分类分析显示，Stramenopiles（平均相对丰度40.07%）为观测期最优势超类群，其次为Alveolata（37.54%）。Stramenopiles中Ochrophyta显著占优（平均85.66%），主要为光合自养种；其余636个ASV（非Ochrophyta stramenopiles）平均相对丰度5.14%，主要为异养型。Labyrinthulomycetes包含172个ASV，占Stramenopiles总相对丰度的1.59%。属水平上*Aplanochytrium*为优势属（占Labyrinthulomycetes总量平均39.01%），其次为*Oblongichytrium*（7.47%）、*Thraustochytrium*（5.26%）和*Labyrinthula*（0.99%）。172个ASV中仅69个（平均40.12%）与SILVA v.138数据库中培养菌株近缘，其余103个（59.88%）代表未培养谱系。共109个ASV被定义为优势（至少1个月占真核群落>0.01%），其中*Aplanochytrium* ASV_L57平均相对丰度最高（0.14%）且全期持续存在。Labyrinthulomycetes群落未显示明显季节模式，这可能归因于其代谢多样性；但RDA表明群落结构显著受温度影响，盐度和SiO?无显著影响。共现分析显示，8个Labyrinthulomycetes ASV（包括*Aplanochytrium* ASV_L42、*Thraustochytrium* ASV_L67和ASV_L72及若干未培养类群ASV_L105、ASV_L119、ASV_L142、ASV_L170、ASV_L171）与*H. akashiwo*动力学呈强正相关（Pearson相关系数>0.7）。由于难以从现场样品中分离对应菌株，研究人员选择与*Thraustochytrium*系统发育近缘、分离自沿岸且易于培养的*Aurantiochytrium* sp. NBRC102614作为模型生物。

*H. akashiwo* H93616与*Aurantiochytrium* sp. NBRC102614的生长特征及定量PCR验证：流式细胞术监测显示，*H. akashiwo*于第8天达到平台期，平均细胞密度4.46×10⁴ cells/mL（4.65 log₁₀ cells/mL），第12天达最大值4.49×10⁴ cells/mL（4.65–4.66 log₁₀ cells/mL）。*Aurantiochytrium* sp.单培养于第5天稳定，平均细胞密度1.04×10⁷ cells/mL（7.01 log₁₀ cells/mL），第12天达最大值1.28×10⁷ cells/mL（7.11 log₁₀ cells/mL）。所建立的qPCR标准曲线线性良好（R2>0.97），扩增效率分别为83.5%和85.4%，证实该方法可用于估计细胞和病毒密度。

*病毒诱导的H. akashiwo裂解刺激Aurantiochytrium增殖*：在三元共培养中，向感染组加入HaV53导致藻细胞密度迅速下降，*H. akashiwo*于第3天降至检测限以下，证实有效的病毒介导细胞裂解；未感染培养中藻细胞密度稳定在平均1.69×10⁵ cells/mL。与未感染培养和对照（仅*Aurantiochytrium*）相比，感染组中*Aurantiochytrium*生长显著受刺激（P<0.05），感染培养中*Aurantiochytrium*细胞密度于第6天达峰值4.38×10⁶ cells/mL，提示*Aurantiochytrium*对裂解的*H. akashiwo*细胞释放的vDOM作出响应。感染培养中显著更高的生长表明病毒裂解释放的营养脉冲强于自然衰亡。

*病毒感染期间H. akashiwo及其病毒的定量*：为确认藻丰度下降源于裂解而非仅病毒吸附，研究人员监测了*H. akashiwo*和HaV53的基因拷贝数。感染培养中*H. akashiwo* β-tubulin基因拷贝数自第2天起显著下降，与流式细胞术数据一致；同时胞内病毒mcp基因拷贝数在第0天和第2天较高，随后第2天胞外mcp基因拷贝数增加，表明病毒释放；但胞外mcp基因拷贝数在第2天后趋于平台，提示宿主耗竭后病毒粒子不再产生或迅速降解/吸附于有机物。上述结果支持如下机制模型：形成藻华的藻类病毒裂解释放vDOM和病毒粒子进入环境，从而刺激*Aurantiochytrium* sp.等异养原生动物；此外，*Aurantiochytrium*的快速增加与mcp基因检测同时出现，提示该原生动物可能利用病毒粒子本身作为直接营养来源。

**讨论与结论**

讨论部分指出，感染培养中显著更高的生长清楚表明病毒裂解释放的营养脉冲强于自然衰亡，提示Labyrinthulomycetes（尤其*Aurantiochytrium*）可能在藻类裂解事件产生的偶发性有机输入上增殖；不过，13C标记等稳定同位素示踪方法将为碳从*H. akashiwo*来源DOM向*Aurantiochytrium*的转移提供更直接证据。综合结果表明，病毒感染不仅终止藻华，还重塑海洋生态系统中异养微生物群落的组成与功能，凸显了真核异养生物在裂解后营养同化中未被充分认识的作用。结论部分译文：本研究首次利用环境与培养相结合的方法证明，异养Labyrinthulomycetes是病毒感染裂解的有害藻华来源DOM的关键且此前被低估的消费者。本研究通过扩增子分析揭示，Labyrinthulomycetes在塑造*Heterosigma*群落中发挥重要生态作用。进一步研究证实，当藻细胞被病毒感染裂解时，大量有机物释放进入水柱，丰富了海洋溶解有机物库。将*Aurantiochytrium* sp.与病毒感染的*H. akashiwo*共培养显示，藻细胞在感染3天后被完全裂解，同时*Aurantiochytrium*细胞密度急剧增加。裂解后*Aurantiochytrium* sp. NBRC102614生长的明显差异表明，裂解藻细胞释放的有机物显著促进异养真核生物的生长。这些过程可能介导藻源有机物向异养微生物消费者的高效传递。综上，研究结果表明这些机制促进了源自病毒感染*H. akashiwo*的有机物向异养Labyrinthulomycetes的传递并增强其生长。