梅毒螺旋体青霉素结合蛋白编码基因变异的谱系特异性与地理结构化分布：基于737株全球基因组的多中心分析

《Microbiology Spectrum》：Lineage-specific and geographic structuring of variants in genes encoding penicillin-binding proteins in Treponema pallidum

　　

中文摘要翻译 为刻画梅毒螺旋体（Treponema pallidum）中编码青霉素结合蛋白（PBPs）或β-内酰胺相互作用蛋白的基因的全球突变景观，研究人员考察了亚种及谱系特异性分布模式与地理异质性，并为解读β-内酰胺类药物敏感性降低的潜在分子基础提供参考。研究人员以Nichols株（GenBank：CP004010.2）为参考基因组，分析了来自六大洲40个国家的737株梅毒螺旋体全基因组序列。在四个编码青霉素结合或β-内酰胺相互作用蛋白的基因——pbp1、pbp2、mrcA和tp47——中鉴定出非同义变异。在排除NA（无有效测序信息）位点后，研究人员使用位点特异性可调用分母计算了位点水平变异频率。精确突变谱分析仅限于在所有61个位点均可调用的462株基因组。研究人员采用基于Pearson χ2统计量的条件固定边际蒙特卡罗检验评估组间差异，并采用Benjamini–Hochberg方法进行多重比较校正；关联强度以Cramér's V量化。共鉴定出61个非同义变异位点。这些变异分布不均，集中于有限的重复性位点，并呈现清晰的亚种及谱系特异性模式。SS14谱系以pbp1 P564L与tp47 S394R的频繁共现为特征，与保守的核心变异谱一致。相比之下，mrcA A506T与Nichols谱系相关（V = 0.496），而tp47 V18A在所有可调用的梅毒螺旋体亚种pertenue（TPE）和endemicum（TEN）基因组中均被检出，与TPE/TEN共有的相对于Nichols的背景差异一致（V = 1.000）。在462株完整可调用基因组中，295株（63.9%）携带精确的多位点变异谱。涉及三个基因的变异谱最为常见，见于241/462株基因组（52.2%），且主要分布于SS14谱系。对变异阳性基因组的地理分析显示显著的区域结构化模式，但这些模式应在亚种和谱系组成的背景下加以解读。欧洲和北美洲富集四核心位点组合（pbp1 P564L + mrcA G708S + mrcA M625V + tp47 S394R），东亚富集含A506V的pbp1–mrcA–tp47三基因变异谱，而非洲和大洋洲主要以与TPE流行相关的单一位点tp47 V18A变异为特征。梅毒螺旋体中编码青霉素结合或β-内酰胺相互作用蛋白的基因呈现谱系特异性和地理结构化的非同义变异。研究人员提出“核心骨架加区域附属”模型：SS14谱系携带广泛分布的保守核心变异谱，而区域差异由额外附属变异以及亚种和谱系组成共同塑造。该框架支持在进化与地理背景下解读候选β-内酰胺相互作用位点，并凸显持续全球分子监测的价值。

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一、研究背景与意义

梅毒是由梅毒螺旋体苍白亚种（Treponema pallidum subsp. pallidum，TPA）引起的古老性传播感染。梅毒螺旋体复合群还包括两个密切相关的致病亚种：雅司病病原体T. pallidum subsp. pertenue（TPE）和地方性梅毒（bejel）病原体T. pallidum subsp. endemicum（TEN）。三个亚种基因组相似度超过99%。梅毒在全球范围内仍是重大公共卫生负担，低收入地区负担尤为沉重，同时高收入国家近年来也报告了显著回升。尽管青霉素已临床应用超过70年，梅毒螺旋体中尚未有确证的表型或临床青霉素耐药病例，但已有研究提出了β-内酰胺敏感性降低的生物学可行路径。约25%的早期梅毒患者存在中枢神经系统侵犯，而肌注苄星青霉素G无法在脑脊液中达到杀螺旋体浓度，中枢神经系统中持续存在的螺旋体可能暴露于较低药物浓度，从而为对β-内酰胺敏感性具有中等效应的变异提供维持或选择的潜在环境。此外，近期有神经梅毒患者接受高剂量头孢曲松治疗失败的临床报告。梅毒螺旋体缺乏质粒、噬菌体和转座子，水平获得耐药决定簇的可能性极低，因此编码青霉素结合蛋白或β-内酰胺相互作用蛋白的基因中自然存在的变异成为基线基因组监测的重要靶点。然而，当前数据仍呈碎片化状态，缺乏涵盖TPA、TPE、TEN及SS14和Nichols两大主要TPA谱系的大规模多位点变异组合分析，变异与亚种、谱系及地理来源的关系也尚未得到系统刻画。为填补这一空白，研究人员分析了覆盖多国多区域的地理广泛基因组数据集，为未来梅毒螺旋体复合群的分子监测提供基线框架。

二、研究设计与方法概述

研究人员从PubMLST、NCBI及关联公共基因组资源获取了公开可用的梅毒螺旋体草图和完整基因组装配序列及WGS（全基因组测序）读段数据，最终构建了包含737株非冗余基因组的全球数据集，覆盖六大洲40个国家，其中TPA 675株、TPE 56株、TEN 6株；TPA内部分为SS14谱系484株和Nichols谱系191株。样本来源包括PRJNA305961、PRJNA723099、PRJNA815321等公开BioProject及ENA/SRA记录，以及UW系列记录。研究人员以Nichols株（GenBank：CP004010.2）为参考基因组，对WGS样本采用FastQC质控、Trimmomatic去接头与低质量碱基、BWA-MEM比对、SAMtools处理及GATK去除PCR重复；对草图中序列采用Bowtie2比对目标基因评估基因回收与覆盖度，MAFFT进行多序列比对。变异鉴定采用SAMtools mpileup与BCFtools call，深度低于10×的位点编码为NA。谱系分配采用Grillova MLST框架（TP0136、TP0548、TP0705）、PubMLST注释及全基因组系统发育定位。统计分析采用条件固定边际蒙特卡罗检验（200,000次重复）评估组间差异，Benjamini–Hochberg方法校正多重比较（q < 0.05为显著），Cramér's V量化关联强度，分层bootstrap重抽样（10,000次迭代）估计95%置信区间。功能预测采用SIFT和PROVEAN在线服务器。

三、研究结果

数据集概览与谱系时空分布

737株基因组中，698株满足主要可调用阈值，39株因缺失率较高但仍在至少一个靶位点提供明确调用而被保留。时间采样分布不均：1998–2009年185株以马达加斯加和美国为主；2010–2015年188株覆盖欧洲、北美洲、非洲和大洋洲；2016–2022年333株以中国、日本、英国和加拿大为主。SS14谱系内pbp1 P564L和tp47 S394R在三个时期均接近固定（q = 0.328和q = 1.000），表明其后期总体频率升高主要反映SS14基因组代表性增加。SS14谱系内mrcA A506V频率从1998–2009年的5.1%升至2016–2022年的47.8%（q < 0.001），而mrcA G708S、M625V和A506T在后期频率降低。Nichols谱系内mrcA A506T频率从13.6%升至97.5%（q < 0.001）。这些对比模式不支持主要β-内酰胺相关位点的一致时间性升高，未被视为时间性选择或耐药出现的证据。地理分布上，亚洲153株（中国86株、日本64株），欧洲237株，北美洲185株，非洲125株，大洋洲27株，南美洲10株。

青霉素结合蛋白编码基因突变模式概览

四个靶基因共鉴定出61个非同义替换：pbp1 6个、pbp2 19个、mrcA 17个、tp47 19个。变异分布极不均匀，集中于少数重复性位点。tp47 S394R在可调用基因组中频率为63.5%（386/608），pbp1 P564L为62.2%（339/545）。mrcA 四个高频位点中，G708S为38.0%、M625V为34.6%、A506V为21.3%、A506T为15.8%。pbp2 最高频替换为I415F（5.1%）。另鉴定出15个同义替换，其中唯一重复性同义替换pbp1 c.387G>C（p.Val129=）见于44株，全部属于TPE或TEN。

突变功能影响预测

SIFT预测显示pbp1、pbp2和mrcA中大多数突变为耐受性，仅tp47 S394R被预测为有害；PROVEAN则将P564L、G708S、A366V、A506V、P44L和A506M预测为有害。两种算法在谱系标记突变pbp1 P564L和tp47 S394R的评价上存在显著分歧，且没有任何突变被两种算法同时预测为有害，凸显了计算机模拟评估的不确定性。

亚种与谱系特异性变异谱

在462株完整可调用基因组中，82株无检出变异，85株为单变异谱，295株为多变异谱。单变异谱中，mrcA A506T与Nichols谱系相关（V = 0.528），tp47 V18A与TPE强相关（V = 0.949），两者经校正后均显著（q < 0.001）。多变异谱中，最常见的精确谱为pbp1 P564L + mrcA M625V + mrcA G708S + tp47 S394R，见于134株且仅限SS14谱系（V = 0.506）；第二常见谱为pbp1 P564L + mrcA A506V + tp47 S394R，见于61株，同样仅限SS14谱系（V = 0.309）。TEN中六株有四株共享pbp2 L308F + mrcA G708S + tp47 V18A + tp47 R243H谱（V = 0.815）。共现矩阵显示pbp1 P564L与tp47 S394R在325株中共同检出，mrcA M625V与G708S完全共现。谱系分层分析显示，SS14基因组中98.6%为多变异谱；Nichols基因组中57.9%无变异、37.9%为单变异谱且以mrcA A506T为主；TPE基因组中90.6%仅携带tp47 V18A。

变异谱的地理分布与区域结构

ttp47 V18A单变异谱在非洲占23.1%、大洋洲占50.0%，其他区域未检出（V = 0.469，q < 0.001）。mrcA A506T单变异谱分布较广，见于欧洲（16.7%）、大洋洲（12.5%）、北美洲（9.6%）、非洲（9.3%）和亚洲（8.9%）。多基因谱中，含A506V的谱在亚洲（主要中国和日本）富集：pbp1 P564L + mrcA A506V + tp47 S394R占亚洲完整可调用基因组的39.0%，而欧洲仅1.9%、北美洲1.2%、非洲0.9%（V = 0.519，q < 0.001）。欧洲和北美洲则以pbp1 P564L + mrcA M625V + mrcA G708S + tp47 S394R核心三基因四站点谱为特征，分别占68.5%和50.6%，而亚洲仅6.2%，非洲未检出（V = 0.656，q < 0.001）。

四、讨论与结论

研究人员提出“核心骨架加区域附属”模型：SS14谱系相关骨架包括pbp1 P564L、tp47 S394R、mrcA G708S和mrcA M625V，而mrcA A506V和tp47 V18A等额外变异按谱系和采样背景分布。该框架用于组织数据集中观察到的共现结构，指导系统发育定位、分子监测和功能验证，不应被解读为临床β-内酰胺耐药或耐受已出现的证据。研究存在局限性：地理采样高度不均，欧洲贡献最多基因组（n = 237），大洋洲（n = 27）和南美洲（n = 10）代表性不足；亚洲样本以中国和日本为主，非洲样本主要来自马达加斯加和利比里亚；时间比较受采样不均限制。所有频率应被解读为737株公共数据集内的相对比例而非全球流行病学患病率。研究结论为：在最终737株基因组数据集中，梅毒螺旋体青霉素结合蛋白或β-内酰胺相互作用蛋白编码基因的变异呈现谱系特异性和地理结构化的共现模式，支持核心骨架加区域附属框架，该框架旨在组织观察到的共现结构并指导系统发育定位、分子监测和功能验证，不应被解读为临床β-内酰胺耐药或耐受已出现的证据。