## 人类肠道共生菌 *Megasphaera elsdenii* 的基因组学见解：与动物分离株的亲缘关系及代谢潜力比较

《Microbiology Spectrum》：Genomic insights into the human gut commensal Megasphaera elsdenii: relatedness and metabolic potential compared to animal isolates

　　

*Megasphaera elsdenii* 作为家畜瘤胃微生物群落中主要的乳酸消耗菌而广为人知，其代谢特性已得到相对充分的研究。在人类中，该菌可从健康供体粪便中分离，且更常见于具有多种炎症性疾病的患者粪便中。该物种的遗传多样性尚知之甚少，目前尚不清楚人源与动物源肠道分离株是否具有遗传相关性并执行相同的代谢功能。本研究将86个人粪便来源（作为人类肠道的替代指标）的 *M. elsdenii* 基因组与动物肠道分离株基因组进行比较。系统发育分析（phylogenetic analysis）揭示，人源与动物源肠道谱系混杂于单一的、遗传高度同质的进化分支内，缺乏任何宿主特异性聚类。尽管消化道存在差异，人源肠道谱系与猪源和牛源肠道分离株共享大部分基因和生化通路。无监督（unsupervised）与有监督（supervised）方法均未鉴定出不同宿主特异性肠道谱系间编码通路的显著差异。基因组尺度代谢模型（genome-scale metabolic modeling）提示，人源与动物源肠道谱系可能具有相同的碳源和能源需求。此外，无论宿主如何，所有研究样本对乳酸（lactate）和乙酸（acetate）的需求均高度保守。最后，研究人员未发现毒力基因（virulence genes），而乳酸利用仍是 *M. elsdenii* 在宿主肠道中蓄积的合理解释。

**研究背景与问题**：*Megasphaera elsdenii* 是瘤胃中著名的乳酸利用菌和脂肪酸产生菌，可发酵乳酸产生丙酸、丁酸、戊酸等C₂–C₆挥发性脂肪酸及CO₂和H₂，能稳定瘤胃酸度，被视为有前景的益生菌。在人体肠道研究中，粪便菌群常作为下消化道菌群的替代指标，该菌可从健康人粪便分离，但在急性HIV感染、CADASIL动脉病、结直肠癌（CRC）、银屑病等炎症性疾病患者粪便中丰度更高。既往有研究报道CRC患者来源分离株可经脂多糖（LPS）诱导TLR4信号激活树突状细胞，但未提供免疫原性（即针对该菌的适应性免疫应答）证据，其结果与瘤胃分离株LPS的典型免疫刺激能力一致。既往基于全基因组的分析仅用两株人源分离株，难以覆盖物种遗传多样性；该物种遗传多样性认识不足，人源与动物源分离株是否遗传相关、是否执行相同代谢功能尚不清楚，不同菌株间遗传组成与功能是否存在可检测差异亦不明确。为此，研究人员采用比较基因组学，汇编健康供体与银屑病患者来源序列、已发表的动物肠道分离株基因组及人阴道系统型作为背景，以解析该菌的进化关系、遗传多样性与代谢潜力。

**主要技术方法**：样本队列来源为一项银屑病病例对照研究中的47名健康成人供体和53名银屑病患者粪便宏基因组，从中选取13份 *M. elsdenii* 相对丰度高且测序reads（>50,000）足以组装基因组的样本。方法包括：用metaSPAdes组装基因组，分别以基于分箱（MetaBAT 2、CheckM评估）和基于参考序列（Minimap2）两种策略获得宏基因组组装基因组（MAG），并用BUSCO与QUAST评估质量；以Prokka注释基因、FACoP.v2归类KEGG通路；用Roary与Phandango构建泛基因组；基于BUSCO单拷贝直系同源基因超级矩阵用IQ-TREE构建最大似然系统发育树（ITOL可视化）；用MicrobiomeAnalyst进行Ward聚类与主成分分析（PCA），用LEfSe进行有监督判别分析；基于CAZy数据库用MMseqs2鉴定碳水化合物活性酶（CAZymes）；用gapseq重建基因组尺度代谢模型预测厌氧生长所需营养；用MMseqs2检索VFDB 2022毒力因子，并以VirulentHunter（基于预训练ESM2蛋白语言模型）探索结构相似蛋白。

**研究结果**：

人源 *M. elsdenii* 与动物肠道分离株差异甚微 研究人员将11个MAG（来自银屑病患者及1名健康供体）与NCBI公开基因组合并，经质量过滤后保留86个基因组，通过平均核苷酸一致性（ANI）分析发现部分标注为不同种的分离株ANI>95%甚至达100%；层次聚类显示一个由人源与动物源肠道样本混杂组成的大簇，分支短，提示近期分化。对去冗余（≥99% ANI）后的37个样本聚类，将肠道来源谱系标为"gut_1""gut_2""gut_3"；阴道相关 *Megasphaera* 种构成另一异质分支（"mixed"、"vag_1"、"vag_2"），其分歧程度显著高于不同宿主的肠道分离株。人源粪便谱系属于由反刍动物（牛）与非反刍动物（猪）分离株组成的遗传同质簇，无宿主特异性聚类迹象。

基于直系同源基因的系统发育分析 基于单拷贝直系同源基因构建的有根系统发育树（含 *Dialister*、*Veillonella*、*Negativicoccus* 及 *Clostridium botulinum* 外群）显示，*M. elsdenii* 与其他 *Megasphaera* 种明显区别于近缘属；*Anaeroglobus geminatus* 单一样本与 *Megasphaera micronuciformis* 聚在一起而位于其他 *Megasphaera* 分支之外，支持将其重新归类为 *Megasphaera* 的推断。该分析重现了ANI推断：阴道相关种与肠道种间存在主要分歧，而肠道相关谱系间分歧较弱，半数人源谱系与动物分离株混杂，gut_2与gut_3仅与动物分离株呈极短分支。

构建种间泛基因组 基于系统发育关系分组并可视化的泛基因组热图显示，阴道生态位相关 *Megasphaera* 种的遗传组成与肠道 *M. elsdenii* 谱系差异巨大，种间泛基因组的大部分基因在阴道相关种中缺失；而不同宿主的肠道谱系在此粗略尺度上无显著基因含量差异。因阴道种与肠道谱系的巨大差异可能掩盖肠道谱系间的细微差别，后续代谢预测剔除了阴道相关种。

KEGG通路与CAZymes分析 KEGG通路丰度热图（Ward聚类）与PCA（PC1占23%、PC2占13%变异）均未按宿主来源将人源与动物源肠道样本分开；有监督LEfSe分析虽排出若干通路，但LDA评分低（0.9至?1.4，均小于2），判别力弱。以CAZy数据库检索同源基因，人、猪、牛源 *M. elsdenii* 平均分别携带36、41、44个CAZyme编码基因，差异无统计学意义（Wilcoxon检验P=0.12–0.59）；CAZy家族比例经ANOVA及Tukey事后检验亦无差异（P=0.17–1）。对CAZy基因家族分布的细化分析显示，各宿主组内基因组间基因数存在变异但非组内共有；此前报道的人源分离株特有而瘤胃型菌株缺失的家族（GH25、GH32、GH43、GH53、GH73、GH77）中，半数为未检出或无差异；部分中质量草图（如MAG36、MAG39、MAG76）注释基因偏少，提示基因缺失模式部分源于基因组质量。

基于基因组尺度代谢模型的营养需求预测 用gapseq对25个基因组（21株人源、4株牛源、4株猪源）重建代谢模型并预测厌氧生长所需化合物。所有肠道谱系均需6种氨基酸（如L-酪氨酸、L-丝氨酸、L-苯丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸）供生长；少数人源与猪源谱系需更多氨基酸及分支酸，其中多数为中等质量MAG。所有肠道谱系均具利用木糖、D-葡萄糖和D-果糖三种简单碳水化合物以及乙酸和L-乳酸的能力，与宿主无关；9/25可潜在利用琥珀酸，仅4/25可潜在利用分支酸（可信度低）。所有样本均携带乳酸通透酶基因（lutP）及lutABC操纵子中的lutC、lutB、lutP基因。

缺乏已知毒力因子基因 以MMseqs2按≥70%序列相似性检索VFDB 2022，未发现已知毒力基因的近似同源物。VirulentHunter预测人源（健康供体与银屑病患者）*M. elsdenii* 的预测毒力因子（pVFs）数量与已知肠道共生菌 *Dialister hominis* 相当，且两者均显著低于真正病原体 *Clostridium botulinum*（ANOVA及Tukey检验，P<0.05）；后者在黏附、效应递送系统、外毒素、免疫调节和运动等多个功能类别中pVFs数量更高。该预测可能噪声较大，仅宜作为探索性步骤。

**讨论与结论**：肠道细菌丰度升高并与炎症相关，可能存在替代解释，即低度炎症改变肠道环境，而专性利用炎症副产物的共生菌由此获益；*M. elsdenii* 相对丰度与粪便钙卫蛋白（肠道炎症生物标志物）线性相关，动物肠道分离株亦在瘤胃菌群失调时增加以消耗乳酸。基于更大样本（全集N=89、去冗余子集N=37），人源谱系不构成独立分支，而与牛、猪分离株混杂且构成高度同质进化支，虽预期人源谱系更接近猪源（消化道相似），但并未观察到宿主相关聚类；结合高ANI值，研究人员推测其有近期共同起源，这与早期基于rRNA基因的分析一致。阴道生态位 *Megasphaera* 种的分歧高于不同宿主的肠道谱系，且缺失大部分 *M. elsdenii* 泛基因组元件。既往基于两株人源与一株瘤胃型菌株的研究所报道的CAZyme差异，更可能反映个体分离株特征而非可推广的组间差异。代谢模型预测的营养需求与既往人源分离株研究一致；人源与动物源肠道谱系可归为厌氧肠道微生物交叉喂养链中的次级/中间消费者，可能同时进行简单糖的一级发酵和乳酸、乙酸二级发酵，这解释了其CAZyme家族不随宿主饮食而变。乳酸利用预测与近期体外实验一致（含 *M. elsdenii* 的批培养从乳酸产生更多戊酸等，且与 *Lactobacillus* 强共现）。但基因组数据无法区分分解代谢物阻遏机制及有机酸与简单糖的偏好，乳酸偏好目前仅在瘤胃分离株中经实验证实；琥珀酸对多数肠道分离株非必需，分支酸需求可能源于基因组组装不完整。综合毒力分析（无近似同源物、pVFs数量与共生菌相当），研究人员认为 *M. elsdenii* 含与已知毒力因子结构相似的蛋白，其数量可能为共生菌而非病原体所典型。综合表明，人源（含银屑病患者）*M. elsdenii* 基因组编码的功能潜力与瘤胃分离株相似，可能在厌氧肠道交叉喂养链中占据相同营养生态位；鉴于银屑病患者存在低度炎症、肠易激综合征及非溃疡性结肠炎等证据，且炎症伴随乳酸升高，患者肠道乳酸增加可合理解释该物种与多种炎症状况的关联。该物种与银屑病的相关性很可能由其消耗乳酸、乙酸和简单糖的代谢特征解释，目前无证据表明其参与银屑病发病机制；该菌仍更可能为肠道共生菌。