《Tropical Plants》：Exploring the systematic positions of two infraspecific taxa of Dioscorea bulbifera based on next-generation sequencing technology, morphology and cytology
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黄独（Dioscorea bulbifera）在其广泛分布范围内表现出显著的形态学和细胞学变异，这导致其种下分类长期存在争议。研究人员结合形态学评估、细胞学分析、质体系统发育基因组学（plastome phylogenomics）和全基因组核单核苷酸多态性（s
黄独（Dioscorea bulbifera）在其广泛分布范围内表现出显著的形态学和细胞学变异，这导致其种下分类长期存在争议。研究人员结合形态学评估、细胞学分析、质体系统发育基因组学（plastome phylogenomics）和全基因组核单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）数据，评估了黄独变种毛芋头薯蓣（D. bulbifera var. kacheo）和黄独变型家山药（D. bulbifera f. domestica）的系统位置。形态学在茎的构造、零余子形态和块茎性状方面区分了各分类群。在所检测的样本中，黄独原变种（D. bulbifera var. bulbifera）在染色体数目上呈多态性（2n = 40、60、80），而所取样的毛芋头薯蓣（2n = 80）和家山药（2n = 60）在现有取样尺度上细胞学上表现一致。质体基因组分析显示家山药为独立单系谱系，而毛芋头薯蓣则嵌套于黄独原变种之内。核基因系统发育将两个分类群均解析为支持良好的单系群，揭示了细胞核质不一致性（cytonuclear discordance）。群体基因组分析显示，家山药与黄独原变种之间的分化程度强于毛芋头薯蓣与黄独原变种之间的分化，同时检测到毛芋头薯蓣与家山药之间存在过量的等位基因共享。因此，两个分类群在形态上均可诊断，但基因组证据呈不对称性：家山药表现出更强的全基因组分化，与变种级别的独特性一致；而毛芋头薯蓣与黄独原变种仅呈弱分化。这些等级比较被视为待更广泛取样验证的工作假说，而非正式的命名修订。整合形态学、细胞学和基因组证据对于评估倍性变异植物类群中的种下边界至关重要。
一、研究背景与科学问题
黄独（Dioscorea bulbifera）为薯蓣科（Dioscoreaceae）多年生缠绕草本植物，其块茎即传统中药"黄药子"，长期用于治疗甲状腺肿、咽炎、化脓性皮肤感染、睾丸炎及肿瘤等疾病。近年来的植物化学与药理学研究进一步报道了其提取物及生物活性成分（尤其是甾体皂苷、黄酮类和二萜类化合物）具有抗癌、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗氧化及免疫调节等活性。此外，该物种在非洲和亚洲部分地区作为粮食作物栽培，在某些地区亦作为观赏植物种植。黄独形态上以卵形至梨形块茎、左旋缠绕且呈绿色至紫红色的茎以及球形至卵形零余子为特征。凭借较强的生态适应性，黄独广泛分布于中国、日本、韩国、印度、缅甸以及大洋洲和非洲部分地区。这一广阔的地理分布范围促进了大量种内变异的积累，导致显著的形态多样性。
黄独的种下分类长期以来存在争议。自19世纪以来，基于形态学依据提出了多种分类处理方案，但尚未达成共识。Prain和Burkill首次对旧世界薯蓣属进行了概要整理，在黄独的种下分类群中认定了毛芋头薯蓣变种；Knuth随后在黄独内识别出八个变种；Prain和Burkill后来对东部物种进行了更详细的记述，进一步细化了种下界定。基于分子标记的研究报道了中国大陆样本与海南、台湾样本之间的遗传分化；基于标本检查和野外调查的研究则主张中国至少存在四个变种。两个历史上被认可的种下分类群为本研究的焦点：毛芋头薯蓣变种最初记述自锡金喜马拉雅及其以东邻近地区，在不丹植物志等区域处理中被保留，主要以茎上具波状膜质翅为诊断特征；家山药变型最初以野山药变型（D. sativa f. domestica）发表，后被转移至黄独变型，主要在日本的植物区系处理中被认定为栽培观赏类型，以零余子形态的显著变异为特征。这些命名遵循历史植物区系惯例而非进化分化评估：在传统植物学实践中，变种被期望在形态可诊断性之外还具有地理、生态和/或系统发育完整性，而变型则适用于缺乏此类形态外完整性的变异类型。然而，现有的大多数分类仍严重依赖形态性状，在环境效应未被充分考虑时可能产生不稳定的界定。特别是支持毛芋头薯蓣和家山药分类地位的有力整合证据仍然缺乏。
细胞学证据，特别是染色体数目和倍性水平，在植物系统学和种下界定中发挥基础作用。多倍化在薯蓣属中广泛存在，同一物种常包含多个细胞型。黄独的亚洲材料通常基于x = 10，而非洲和美洲材料与x = 9相关。文献中记录了体细胞染色体数目2n = 36、40、54、60、80及约100。尽管有这些观察，倍性变异与黄独种下界定之间的关系尚未被明确检验。分子系统学进展为解析薯蓣属复杂的种内关系提供了有力工具。全基因组重测序揭示了白薯（D. rotundata）的杂交起源，群体基因组分析阐明了非洲薯蓣的驯化和多样化模式。对于黄独本身，SSR标记、DArTseq SNP和质体数据已揭示了来自巴西、西非和中国的样本间显著的遗传多样性和地理结构谱系。然而，这些研究大多为种质资源鉴定或育种目的而设计，而非分类界定。因此，毛芋头薯蓣和家山药的进化关系及分类地位仍未得到很好的解决。此外，仅凭质体数据只能捕获母系谱系，在存在杂交或多倍化的类群中可能不足，而核SNP数据则提供核基因组历史的互补解析。
基于上述背景，研究人员采用整合方法，结合形态学观察、细胞学分析、质体系统发育基因组学和全基因组核SNP数据，旨在：(1) 评估分类群间的形态学和细胞学分化；(2) 基于质体和核基因组数据重建系统发育关系；(3) 检测潜在基因流并推断塑造分化的进化过程；(4) 阐明毛芋头薯蓣和家山药的分类地位。
二、主要关键技术方法
研究人员共收集了14份黄独原变种样本，来自中国安徽、福建、广东、广西、河南、湖南、江苏、四川、浙江、重庆、云南、海南和台湾等不同地理区域，另采集2份毛芋头薯蓣样本（采自云南省）和2份家山药样本（商业来源获得）。主要技术方法包括：染色体计数与流式细胞术（flow cytometry）用于倍性测定；基于Illumina NovaSeq 6000平台的二代测序（next-generation sequencing, NGS）；利用GetOrganelle进行质体基因组组装、GeSeq进行注释；基于完整质体序列、79个蛋白编码基因的串联编码序列（coding sequences, CDS）及氨基酸序列数据集，采用IQ-TREE进行最大似然（maximum likelihood, ML）分析和MrBayes进行贝叶斯推断（Bayesian inference, BI）；以黄独原变种单倍型解析基因组为参考，采用Sentieon流程进行全基因组SNP鉴定；利用VCFtools计算核苷酸多样性（π）和遗传分化（FST）；采用Dsuite进行ABBA–BABA检验（D-statistic）评估基因流；利用TreeMix推断群体分裂和迁移事件；采用PLINK进行主成分分析（principal component analysis, PCA）和ADMIXTURE进行群体结构分析。
三、研究结果
形态性状比较： 三个分类群的雌花序形态基本一致，均为穗状、腋生、下垂，花被片6枚白色、雄蕊退化6枚，表明生殖器官结构在种内水平相对保守，主要差异在于营养器官。叶形态呈中等变异：黄独原变种和毛芋头薯蓣均为宽卵状心形叶，而家山药为宽心形叶，长宽比接近1。茎形态分化更为显著：毛芋头薯蓣以具棱茎和沿棱具膜质翅为特征，该特征在其他分类群中缺失；黄独原变种和家山药均具圆柱形茎，但前者常为暗红色或绿色带红色条纹，后者通常为翠绿色且近无毛。零余子形态差异较大：黄独原变种产生近球形零余子，具不规则排列的凹陷；毛芋头薯蓣具近球形至宽椭圆形零余子，具规则排列的突起；家山药零余子形态高度变异，常具棱且带不同大小的不规则排列突起。块茎形态差异显著：黄独原变种形成发育良好的膨大地下块茎，直径8.0–13.0 cm；毛芋头薯蓣块茎形态结构基本相似，但尺寸较小（直径4.0–5.0 cm）；家山药几乎不形成块茎（直径仅1.0–1.5 cm），茎与根状茎连接处具发达的须根。
染色体数目与基因组大小估算： 所有样本的染色体极小且呈点状。黄独原变种在所检样本中染色体数目变异：海南陵水样本（HNLS）为2n = 40，海南海口样本（HNHK）为2n = 60，浙江丽水样本（ZJLS）为2n = 80。毛芋头薯蓣样本（JCHD1）在所有计数细胞中一致显示2n = 80，家山药样本（YZ1）一致显示2n = 60。流式细胞术估算的基因组大小与染色体数目比例一致：2n = 80样本基因组最大（1.31 Gb和1.38 Gb），约为2n = 40样本（0.66 Gb）的两倍；2n = 60样本呈中间值（1.02 Gb和1.15 Gb）。
质体基因组特征与比较： 共组装了17个质体基因组，大小范围为152,970–153,256 bp，均呈现典型的四分体结构，包括大单拷贝区（large single-copy region, LSC）、小单拷贝区（small single-copy region, SSC）和一对反向重复区（inverted repeats, IRs）。所有样本GC含量一致（37.0%），每个质体基因组含113个基因，包括79个蛋白编码基因、30个tRNA基因和4个rRNA基因，其中19个基因在IR区重复。IR/SC边界分析显示所有样本间边界构型高度一致，仅在家山药两个样本中检测到IR区≤6 bp的微小长度变异。
系统发育关系、群体结构与基因流： 基于79个质体基因的CDS和氨基酸序列的ML分析仅对家山药的单系性提供强支持，其余种内关系解析较差。完整质体序列的ML和BI分析提供更强的种内关系解析。在质体系统发育树中，两个家山药样本形成强支持的单系支，为所有其余黄独样本的姐妹群（SH-aLRT/UFBoot/PP = 100/100/1.00），构成种内的早分歧谱系。相反，两个毛芋头薯蓣样本未能聚为单支，而是与中国东南、南部和西南部（福建、台湾、广东、广西、重庆）的黄独原变种群体聚为一个单系支（SH-aLRT/UFBoot/PP = 100/100/1.00）。在核SNP系统发育树中，家山药同样形成独立且强支持的支（SH-aLRT/UFBoot = 100/100），为其余种内群体的姐妹群。毛芋头薯蓣则不再嵌套于黄独原变种之内：JCHD1和JCHD2形成强支持的单系支（SH-aLRT/UFBoot = 100/100），为包含所有黄独原变种样本的支的姐妹群（SH-aLRT/UFBoot = 100/100）。两棵树在家山药作为独立早分歧谱系的定位上一致，但对毛芋头薯蓣不一致：该分类群在质体树中嵌套于黄独原变种内，而在核SNP树中则为黄独原变种的独立姐妹支，揭示了细胞核质不一致性。
PCA将三个类群分开，PC1（16.91%）和PC2（13.39%）共解释30.30%的总遗传变异。家山药形成与黄独原变种和毛芋头薯蓣完全分离的独立簇，而毛芋头薯蓣位于黄独原变种簇的外围。ADMIXTURE分析中K = 1交叉验证误差最低；在K = 2时，家山药与黄独原变种/毛芋头薯蓣群体区分，且几乎无混合。核苷酸多样性方面，毛芋头薯蓣最高（π = 6.380 × 10?3），其次为黄独原变种和家山药。成对FST值显示毛芋头薯蓣与家山药之间分化最强（0.5051），黄独原变种与家山药之间分化中等（0.2801），黄独原变种与毛芋头薯蓣之间分化最弱（0.0752）。D-statistic分析获得显著正值（D[HD, JC, YZ, O] > 0，|Z| > 3，p < 0.001），表明毛芋头薯蓣与家山药之间存在过量等位基因共享。TreeMix分析确定m = 1为最优模型，检测到从家山药到毛芋头薯蓣的单一迁移边（权重 = 0.183）。
四、讨论与结论
种下分化与分类学意义： 整合数据集揭示了三个分类群间清晰的形态学和细胞学分化，以及基因组分化水平的显著不对称性。形态上，两个焦点分类群均可相对于黄独原变种进行诊断：毛芋头薯蓣以具棱茎和沿棱膜质翅为特征，家山药以宽心形叶（长宽比近1）、高度变异且常具棱的零余子以及几乎不形成膨大块茎为特征。细胞学上，黄独原变种样本涵盖2n = 40、60、80的倍性变异，而毛芋头薯蓣（2n = 80）和家山药（2n = 60）在现有取样中各自一致且彼此不同，表明细胞型变异在种内和种间均有分布。系统发育基因组学和群体遗传分析进一步解析了两个分类群，但程度显著不同。家山药在每一类分子证据中均一致分化：在质体树中为强支持的早分歧谱系，在核SNP树中为最大支持的支，在PCA中为独立簇，在ADMIXTURE中携带近乎未稀释的祖先成分，与黄独原变种的分化显著（FST = 0.2801）。相比之下，毛芋头薯蓣在多项分析中无法与黄独原变种分离：在质体树中嵌套于黄独原变种样本之间，在PCA中位于原变种簇外围，仅显示弱全基因组分化（FST = 0.0752），尽管在核SNP树中为独立支。基于此，家山药比毛芋头薯蓣更接近遗传分化的种下谱系。毛芋头薯蓣的模式——清晰的形态诊断而无相应的全基因组分化——表明表型与核群体结构不一致。形态可诊断性本身不足以将毛芋头薯蓣与家山药在进化独立性程度上等同。这一不对称性与历史植物区系处理中将变种等级赋予毛芋头薯蓣、将变型等级赋予家山药的做法不一致。研究人员应用了操作标准：变种地位需要可诊断形态、实质性全基因组分化以及系统发育和群体遗传分析的一致性支持；无伴随全基因组分化的形态分歧更符合变型。在此标准下，家山药更符合变种等级的证据预期，而毛芋头薯蓣主要满足形态学标准。鉴于每个焦点分类群仅有两个样本且分布范围狭窄，正式命名调整尚不成熟，研究人员保留历史应用的等级并将数据暗示的等级视为可检验的工作假说。
细胞核质不一致性与网状进化： 质体和核SNP树在家山药作为独立早分歧谱系的定位上一致，但在毛芋头薯蓣的位置上强烈不一致。质体反映母系遗传，核基因组捕获双亲进化过程。细胞核质不一致在植物中广泛存在，通常归因于不完全谱系分选（incomplete lineage sorting, ILS）、杂交和基因渐渗。群体基因组分析为历史基因交换提供了补充证据：显著正D-statistic表明毛芋头薯蓣与家山药之间存在相对于测试拓扑的过量等位基因共享，TreeMix恢复了从家山药到毛芋头薯蓣的迁移边。这些结果与渐渗导致观察到的不同质性一致，但不排除ILS的实质性贡献。研究人员将系统发育不一致解释为更符合网状进化模型而非严格二分历史，同时承认现有数据无法完全区分渐渗和ILS的相对贡献。鉴于黄独中已记录的细胞学异质性，倍性间基因流也可能相关。家山药在两个基因组区室中的一致定位进一步表明其独特性不限于单一遗传系统。
研究结论： 本研究通过结合全基因组核SNP数据、质体变异、细胞学证据和形态性状，为评估黄独种下分类关系提供了整合框架。结果表明，家山药代表一个遗传分化的种下谱系，受系统发育和群体基因组分析一致模式的支持。相比之下，毛芋头薯蓣在形态上可诊断，但与黄独原变种仅显示有限的全基因组分化，表明表型分歧不一定伴随实质性基因组分化。观察到的细胞核质不一致进一步表明黄独的进化历史不太可能符合严格二分模型。群体基因组分析与历史基因流导致这种不一致一致；然而，不完全谱系分选不能被排除，这些过程——以及潜在倍性间基因流——的相对贡献尚无法完全区分。总体而言，这些发现阐明了黄独历史上认可的种下分类群间的不对称分化，并强调了在分类复杂的植物类群中评估种下边界时整合形态学、细胞学和基因组证据的价值。正式的命名修订应等待更广泛的地理取样。
