耐盐碱与盐碱敏感生姜（Zingiber officinale Roscoe）在盐碱胁迫下生理与转录组的协同响应

《Vegetable Research》：Synergistic physiological and transcriptomic responses in ginger (Zingiber officinale Roscoe) with different saline–alkali sensitivities under salt–alkali stress

　　

盐碱地是亟待高效利用的重要耕地资源储备。迄今为止，关于生姜（Zingiber officinale Roscoe）对盐碱胁迫响应的研究仍十分有限。本研究构建了模拟盐碱土壤环境（pH 7.8，含盐量0.3%），比较耐盐碱生姜品种'2404'（T）与敏感品种'61'（S）的生理及转录组响应。结果表明，胁迫7 d后，品种T的叶绿素a含量和净光合速率分别下降12.27%和33.93%，而品种S分别下降50.78%和94.11%。品种T快速且持续积累脯氨酸和可溶性糖，抗氧化酶活性显著增强。处理5 d后，T的过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽还原酶（GR）活性分别比S高64.94%、93.14%和37.75%。整个胁迫期间，T的还原型谷胱甘肽（GSH）含量始终显著高于S，处理10 d后S的GSH含量比T低70.00%。转录组分析与加权基因共表达网络分析鉴定出9个hub基因，可作为未来生姜功能研究最具前景的候选靶标。总之，盐碱胁迫下耐盐碱品种维持了较高的光合能力，并表现出强大的抗氧化和渗透调节能力。本研究为生姜耐盐碱基因的筛选与功能验证提供了有价值的参考。

研究背景方面，土壤盐渍化已成为制约全球农业可持续发展的重大挑战，全球盐碱地面积超过11亿公顷，其中约40%为碱性土壤。天然盐碱土壤离子组成复杂，通常含Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^?和SO₄^2?，碱性土壤因HCO₃^?和CO₃^2?浓度高而pH升高。盐碱胁迫通过破坏土壤理化性质、制约作物生产力并损害生态系统功能对植物造成多重伤害。中国是世界主要生姜产地之一，随着连作年限延长，多数传统产区日益面临土壤盐渍化和pH升高问题，生姜受盐碱胁迫时表现典型叶片损伤，严重时减产可超过30%。盐碱胁迫对植物施加渗透胁迫和离子毒害，导致生理性干旱和矿质营养吸收受损，进而触发活性氧（ROS）过量产生，引起氧化胁迫等次生伤害。叶片作为光合作用主要场所对盐碱胁迫高度敏感，胁迫增加叶片Na⁺积累并降低K⁺含量，Na⁺/K⁺比失衡破坏离子和渗透稳态，抑制植物生长。植物应对盐碱胁迫已演化出一系列适应机制，主要涉及重建离子稳态、调节渗透平衡和清除ROS。尽管上述机制在多种植物中已被广泛记载，但不同植物类群对盐碱胁迫响应存在明显种间特异性，迄今为止关于姜科植物对盐碱胁迫响应的研究极为匮乏。生姜是浅根性植物，根系对土壤环境变化高度敏感，最适土壤pH为5.8~7.0，耐盐阈值约0.35%，属典型盐碱敏感作物。迄今尚无研究报道耐盐碱与敏感生姜品种叶片在盐碱胁迫下的动态生理响应或比较转录组分析。

研究人员以耐盐碱生姜种质为材料、敏感种质为对照开展研究，目的是分析二者在盐碱胁迫下的动态生理差异，并通过转录组分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定与耐盐碱性显著相关的hub模块和hub基因，为生姜耐盐碱基因筛选和功能验证提供参考。研究提出以下假设：（1）耐盐碱品种维持更高的光化学效率；（2）耐盐碱品种积累大量渗透调节物质；（3）耐盐碱品种表现更高的抗氧化系统活性；（4）信号转导等相关通路基因在耐盐碱品种中显著富集。系统阐明生姜耐盐碱分子调控网络，不仅可为扩大生姜在盐碱地上的栽培提供理论基础，还可为姜科作物耐逆分子育种提供关键基因资源和选择标记。

技术方法方面，研究于2025年在山东农业大学科技创新园开展，供试材料为耐盐碱品种'2404'（T）和盐敏感品种'61'（S）。生姜催芽后播种于装土3.6 kg的塑料盆中，株高约60 cm时选取生长一致的植株分为对照和处理组。处理组先按干土重0.3%加入中性盐（NaCl∶Na₂SO₄ = 1∶1，w/w），再灌1 mol·L^?1 KOH溶液调土壤pH至约7.8，设Tn、Ts、Sn、Ss四个处理，每处理24株、4次重复，于处理后1、3、5、7、10 d取样测定指标；转录组测序于处理后1、5、7 d取顶部第三片完全展开功能叶，液氮速冻后?80 ℃保存，所有样品3次重复。主要技术方法包括：采用Ciras-3光合系统测定光合气体交换参数，m-PEA荧光仪测定快速叶绿素a荧光诱导动力学（OJIP）曲线，MINI-IMAGING-PAM叶绿素荧光成像系统测定荧光参数；采用硫代巴比妥酸法等测定丙二醛（MDA）、H₂O₂和超氧阴离子（O₂^?）含量，考马斯亮蓝法和蒽酮比色法测定可溶性蛋白和可溶性糖，茚三酮法测定脯氨酸；用商业试剂盒测定GSH和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量并计算GSH/GSSG比值，按相应方法测定超氧化物歧化酶（SOD）、POD、CAT和GR活性；转录组测序由北京诺禾致源公司完成，FastQC验证序列质量，HISAT2比对参考基因组，DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs），并进行GO、SwissProt和KEGG富集分析，随机选取9个DEGs以ZoRPII为内参基因进行qRT-PCR验证；基于FPKM值在BMKCloud平台进行WGCNA分析；采用DPS软件进行单因素方差分析，Duncan新复极差法进行多重比较（p < 0.05）。

研究结果如下：

盐碱胁迫对生姜叶片叶绿素含量和光合气体交换参数的影响：处理7 d时两品种叶片表型差异明显。与Tn相比，Ts的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素（a+b）和类胡萝卜素含量分别下降12.27%、10.00%、16.98%和11.41%；而Ss相对Sn降幅更大，分别为50.78%、56.31%、51.92%和52.49%。光合参数方面，Ts的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、水分利用效率（WUE）和 stomatal conductance（Gs）分别下降33.93%、17.91%、11.54%和16.20%，胞间CO₂浓度（Ci）升高22.12%；Ss的Pn、Tr、WUE和Gs分别骤降94.11%、71.59%、79.47%和70.10%，Ci升高42.55%。这表明敏感品种光合抑制可能由早期以气孔限制为主逐渐转为以非气孔限制为主。

盐碱胁迫对生姜叶片光系统II的影响：处理7 d时两品种OJIP瞬变曲线均发生明显改变。经Vt = (Ft ? F0)/(Fm ? F0)归一化后，Ts的K–J和J–I相振幅较小，而Ss的O–K、K–J和J–I相振幅明显大于Ts。差分归一化（ΔVt = Vst ? Vck）呈双峰曲线，盐碱胁迫下峰值主要出现在O–K和K–J相；两品种Vk、Vj和Vi值均较各自对照升高，但Ss的Vk和Vj增幅显著大于Ts。荧光成像显示处理7 d时Ts的Fv/Fm图像颜色较深，而Ss呈浅蓝色甚至含绿色区域；Ts的Y(II)伪彩色较Tn变浅，Ss的Y(II)图像呈黄褐色。定量分析表明，与Tn相比，Ts的Fv/Fm、Y(II)和光化学猝灭（qP）分别下降7.67%、20.53%和7.74%，Y(NPQ)升高29.18%；与Sn相比，Ss的Fv/Fm、Y(II)和qP分别下降29.62%、59.01%和55.56%，Y(NPQ)仅升高4.22%。上述结果表明Ss的放氧复合体（OEC）严重失活、PSII供体侧电子传递受到明显抑制、反应中心蛋白广泛降解变性，而T可通过启动调节性能量耗散和光保护机制应对胁迫。

盐碱胁迫对生姜叶片渗透调节物质积累的影响：随胁迫时间延长，Ts在前5 d快速积累大量脯氨酸，之后逐渐稳定；Ss的脯氨酸含量前3 d缓慢升高并达峰，第5天后下降。Ts的可溶性糖含量在整个胁迫期逐渐升高并最终趋于平台；Ss的可溶性糖含量逐渐升高、第3天达峰后下降。Ts的可溶性蛋白含量随胁迫延长逐渐升高、第5天达最大后逐渐下降，但仍高于Tn；Ss的可溶性蛋白含量则持续下降，处理10 d时较Sn降低58.80%。这说明耐盐碱品种能快速、持续合成并积累渗透调节物质，而敏感品种无法维持长期有效的渗透调节。

盐碱胁迫对生姜叶片抗氧化系统的影响：随胁迫延长，两品种MDA含量均逐渐升高，但Ts的MDA含量在第5天后开始稳定；两品种差异在第10天最明显，Ss的MDA含量比Ts高40.13%。Ts的H₂O₂含量在处理第5天达峰后下降，而Ss持续升高，第10天时Ss的H₂O₂含量比Ts高152.45%；O₂^?含量呈类似趋势，第10天时Ss比Ts高74.50%。抗氧化酶活性方面，Ts的SOD活性快速升高并于第3天后逐渐稳定，Ss的SOD活性缓慢升高、第5天达峰后急剧下降；POD、CAT和GR活性变化趋势与SOD类似，处理第5天时Ts的POD、CAT和GR活性分别比Ss高64.94%、93.14%和37.75%。Ts和Ss的GSH含量均呈先升后降趋势，但整个胁迫期Ts的GSH含量始终显著高于Ss，第10天时Ss的GSH含量比Ts低70.00%。Ts的GSSG含量第1天轻微升高后逐渐恢复稳定，Ss的GSSG含量则持续升高，第10天时比Ts高56.90%。随胁迫延长，Ts的GSH/GSSG比值逐渐升高、第5天达峰后轻微下降；Ss的GSH/GSSG比值前5 d略有升高，第5天后开始下降并最终低于对照水平，第10天时Ts的GSH/GSSG比值比Ss高424.96%。这表明耐盐碱品种建立了更高效协调的酶促与非酶促抗氧化防御体系，而敏感品种抗氧化响应不足、GSH库近乎耗竭。

胁迫第7天生理参数的相关分析与主成分分析：26个生理参数的对应分析显示，光合性状（叶绿素、Pn、Gs、Fv/Fm等）彼此正相关（r > 0.85），并与Ci、MDA、H₂O₂和O₂^?负相关（r < ?0.80）；MDA、H₂O₂和O₂^?彼此正相关（r > 0.85）。主成分分析（PCA）双标图中前两个主成分分别解释74.3%和15.8%的方差，胁迫下耐盐碱品种（Ts）位于PC1正向和PC2负向区域，靠近脯氨酸和部分抗氧化酶；胁迫下敏感品种（Ss）位于PC1和PC2正向区域，靠近O₂^?、MDA和Ci；对照组（Tn、Sn）位于PC1负向区域。

耐盐碱与敏感生姜品种盐碱胁迫下DEGs分析：以未处理对照（0 d）为参照，按|log2 (fold change)| ≥ 1且错误发现率（FDR）< 0.05标准鉴定DEGs。敏感品种S在胁迫1、5、7 d分别鉴定到6,415个（3,168上调/3,247下调）、9,331个（4,185上调/5,146下调）和8,642个（3,654上调/4,988下调）DEGs；耐盐碱品种T在相应时间点分别检测到6,791个（2,729上调/4,062下调）、6,271个（2,689上调/3,582下调）和5,264个（2,448上调/2,816下调）DEGs。PCA显示生物学重复间重现性良好。两两比较显示，S0 vs S1、S0 vs S5和S0 vs S7分别含1,036、2,687和2,808个特有DEGs；T0 vs T1、T0 vs T5和T0 vs T7分别含1,788、1,567和1,492个特有DEGs；品种T在1、5、7 d三个时间点共鉴定到2,373个共有DEGs。

DEGs功能富集分析：GO富集分析涵盖细胞组分（CC）、生物学过程（BP）和分子功能（MF）三类。敏感品种S的S0 vs S1、S0 vs S5和S0 vs S7比较分别有47、914和1,345个DEGs富集于CC，2,631、2,852和2,217个富集于BP，889、768和368个富集于MF；耐盐碱品种T的T0 vs T1、T0 vs T5和T0 vs T7比较分别有255、1,209和772个DEGs富集于CC，2,227、1,810和1,462个富集于BP，996、946和1,354个富集于MF。两品种CC类富集基因主要与光合结构相关，包括光合膜、叶绿体膜和类囊体膜。品种S处理1、5、7 d富集BP条目居前两位的均为"对非生物胁迫的响应"和"对含氧化合物的响应"，而品种T中这两个BP条目的富集基因数随胁迫时间延长而减少。MF类中两品种均显著富集于内切核酸酶活性、核酸酶活性和作用于酯键的水解酶活性等条目，值得注意的是耐盐碱品种T还额外富集到无机阴离子跨膜转运蛋白活性和二羧酸跨膜转运蛋白活性相关基因。KEGG富集分析显示，盐敏感品种S富集于12条代谢通路，耐盐碱品种T富集于5条通路；"细胞色素P450对外源物质的代谢"、"α-亚麻酸代谢"和"铁死亡"3条通路在两品种中均富集；"硫胺素代谢"和"甲烷代谢"等通路仅在品种T中富集，这些共有和特有通路可能与生姜耐盐碱相关；"甘油酯代谢"、"半乳糖代谢"、"光合作用–天线蛋白"、"乙醛酸和二羧酸代谢"、"脂肪酸降解"和"托烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成"等通路仅在品种S中富集，可能与盐碱胁迫对生姜造成的损伤有关。

基因表达验证：随机选取9个DEGs进行qRT-PCR分析，所有9个基因的上调或下调趋势在RNA测序（RNA-seq）与qRT-PCR结果间均一致，证实了RNA-seq检测表达模式的准确性。

基于WGCNA的基因共表达网络分析及hub基因鉴定：以FPKM值进行WGCNA分析，筛选阈值>1、变异系数≥ 0.5、软阈值功率为8、最小模块大小为30个基因。基于拓扑重叠矩阵（TOM）构建基因树状图，应用动态树切割算法识别并合并相似模块，共得到17个不同的共表达模块。其中ME-pale turquoise和ME-sienna-3模块与S1（敏感品种第1天）呈强正相关，ME-dark magenta模块与S5高度相关，ME-light green模块与S7强相关；耐盐碱品种中ME-cyan和ME-orange red-4模块与T1高度正相关，ME-yellow green模块与T5相关，ME-dark turquoise模块与T7相关。值得注意的是，ME-medium purple-3模块与S7正相关而与T7负相关，提示其可能包含负调控耐盐碱性的基因。对与胁迫下耐盐碱品种高度正相关的三个模块（ME-cyan、ME-yellow green和ME-dark turquoise）及ME-medium purple-3模块的hub基因进行KEGG富集分析，结果显示ME-cyan模块关键基因显著富集于"内质网中的蛋白质加工"和"PI3K–Akt信号通路"；ME-yellow green模块hub基因显著富集于"氨基糖和核苷酸糖代谢"及"果糖和甘露糖代谢"；ME-dark turquoise模块关键基因显著富集于"α-亚麻酸代谢"、"植物激素信号转导"和"MAPK信号通路"；ME-medium purple-3模块hub基因主要富集于"甲烷代谢"、"半乳糖代谢"和"缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成"。按模块成员度（kME值）排序，选取各模块连接度最高的前三个基因作为hub基因：ME-cyan模块的3个hub基因Zs00007568、Zs00027633和Zs00039195均属热激蛋白/分子伴侣家族；ME-yellow green模块hub基因为Zs00026862、Zs00007356和Zs00027318，主要参与细胞壁组分（包括类几丁质聚合物、葡甘露聚糖和果胶）的生物合成与修饰；ME-dark turquoise模块hub基因为Zs00022285、Zs00031778和Zs00032726，前两者为茉莉酸（JA）信号通路关键调控组分，后者为JA生物合成酶；ME-medium purple-3模块hub基因为Zs00022799、Zs00026296和Zs00037532。

讨论部分总结：研究结果表明，盐碱胁迫下敏感品种的光合抑制由早期气孔限制逐渐转为非气孔限制，其OJIP曲线振幅更大、Vk和Vj增幅更显著，表明OEC严重失活和PSII供体侧电子传递受抑，Fv/Fm和Y(II)降幅更大；耐盐碱品种则通过启动调节性能量耗散和光保护机制维持较高光合能力。渗透调节方面，耐盐碱品种在胁迫早期快速大量积累脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白并全程维持较高水平，而敏感品种仅短暂升高后下降，无法维持长期有效的渗透调节。抗氧化方面，耐盐碱品种SOD、POD、CAT和GR活性快速升高并持续保持，形成完整的ROS清除级联，同时维持显著更高的GSH含量和GSH/GSSG比值，酶促与非酶促系统同步增强形成正反馈环路，有效控制ROS水平、减轻膜脂过氧化并保护光合膜等细胞器结构完整性；敏感品种抗氧化酶活性呈先升后降的不足响应，GSH库近乎耗竭，导致严重叶片损伤甚至植株死亡。相关分析与PCA进一步揭示耐盐碱品种趋向脯氨酸–抗氧化酶空间而敏感品种趋向氧化损伤空间，反映二者通路编排的本质差异。GO富集中耐盐碱品种富集到无机阴离子和二羧酸跨膜转运蛋白活性条目，可能与更高效的离子区隔化及苹果酸转运经苹果酸酶（ME）氧化脱羧生成NADPH（GR再生GSH的必需电子供体）有关，为T中GSH/GSSG比值升高和ROS水平降低提供了直接分子解释。KEGG共富集的"铁死亡"通路在敏感品种中与MDA和H₂O₂持续升高相关，指向不可逆氧化性细胞死亡，而在耐盐碱品种中仅短暂触发、第5天后MDA稳定，提示其作为胁迫预警信号后被强大的GSH抗氧化系统控制；"α-亚麻酸代谢"在两品种中共富集可能与相关基因相反的表达式谱有关。品种T特有的"硫胺素代谢"通路产物硫胺素是碳水化合物代谢和戊糖磷酸途径关键酶的辅因子，其上调可能支持T中持续的糖积累；"甲烷代谢"在生姜叶片盐碱响应中的生物学意义目前缺乏文献支持，可能反映广泛的代谢紊乱，有待进一步研究。品种S富集的"甘油酯代谢"、"半乳糖代谢"和"光合作用–天线蛋白"通路共富集，结合Y(II)和叶绿素含量下降，强烈提示类囊体膜解体与光合复合体降解的转录特征。WGCNA鉴定的三个与耐盐碱品种正相关模块揭示了时序分层的防御策略：ME-cyan模块（第1天）富集于内质网蛋白质加工，以HSP70为hub基因，在内质网应激下通过未折叠蛋白反应（UPR）促进正确蛋白折叠、抑制错误折叠蛋白聚集体积累，这一早期分子伴侣介导的保护响应先于渗透保护溶质积累；ME-yellow green模块（第5天）富集于氨基糖和核苷酸糖代谢及果糖和甘露糖代谢，hub基因CSLA9和GAUT8通过促进细胞壁多糖合成与重塑增强细胞壁机械性能、维持细胞间黏附，防止盐碱胁迫下叶肉组织塌陷，并可能间接促进气孔运动和CO₂传导，这与T较高的Gs和Pn值相符，且其上调与T可溶性糖含量最大值在时间上吻合，提示多余光合产物被重新导向强化细胞壁，可能作为限制离子侵入的物理屏障；ME-dark turquoise模块（第7天）富集于植物激素信号转导和MAPK信号通路，hub基因bHLH148、TIFY和AOC表明JA信号模块在生姜耐盐碱中发挥重要作用，TIFY与AOC同步上调提示负反馈机制，JA合成启动自我放大的信号级联同时诱导TIFY约束过度激活，确保防御输出在时间上受限且精确校准；该模块模块特征基因与CAT和GR活性密切相关，支持JA信号通过依赖磷酸化的转录级联建立负反馈环路减弱氧化爆发、保护光合电子传递链的机制，而敏感品种中JA模块未能激活，导致ROS积累失控、第10天MDA含量升高40.13%。基于上述分析，9个hub基因被列为未来生姜功能鉴定最有前景的候选靶标，其时间表达模式共同勾勒出盐碱耐受的分层调控框架：早期内质网分子伴侣介导的蛋白质质量控制、中期细胞壁碳水化合物生物合成、后期JA介导的ROS稳态，而敏感品种因这些时相解耦联而失败，最终死于铁死亡性细胞死亡；该模型提供了理解生姜耐盐碱性的系统层面路线图，强调育种应优先协同重连这些时间依赖的调控模块而非聚焦单一"超级基因"。

研究结论部分翻译：本研究证明，耐盐碱生姜品种T通过一系列生理和分子策略应对胁迫，包括维持光合结构与功能的相对稳定、高效积累渗透调节物质以缓解渗透胁迫、通过酶促和非酶促途径清除ROS以减轻膜脂过氧化，以及启动涉及离子转运、渗透调节、抗氧化、激素信号和MAPK级联相关通路的转录重编程。相比之下，敏感品种S在上述各层面响应存在不同程度的缺陷或失调。本研究主要分析了盐碱胁迫下两品种的生理差异和候选共表达模块，筛选出9个hub基因，为今后生姜抗逆遗传改良和优良种质资源创制提供了潜在的基因资源。