《Vegetable Research》：Genome-wide identification of the NAC gene family in cucumber based on the V4 genome and the response to high nitrogen
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氮利用效率（NUE）显著影响作物产量并与环境污染密切相关，对黄瓜等需氮量高的作物尤为关键。NAC基因家族是一类植物特异性转录因子，已在大豆、水稻和苹果等作物的NUE中被报道，但其在黄瓜NUE中的作用尚不清楚。本研究基于黄瓜V4基因组鉴定了88个NAC基因。系统
氮利用效率（NUE）显著影响作物产量并与环境污染密切相关，对黄瓜等需氮量高的作物尤为关键。NAC基因家族是一类植物特异性转录因子，已在大豆、水稻和苹果等作物的NUE中被报道，但其在黄瓜NUE中的作用尚不清楚。本研究基于黄瓜V4基因组鉴定了88个NAC基因。系统发育分析将这些基因分为6个亚家族，各亚家族内蛋白质序列高度相关。启动子分析揭示了大量与胁迫响应、激素信号及植物生长发育相关的顺式作用元件。转录组数据表明NAC基因主要在根中表达，62.5%的家族成员呈现共表达模式。利用两个对高氮供应响应相反的黄瓜品系研究NAC基因表达动态。在高氮条件下，高NUE品系L2全株干重增加25.6%，而低NUE品系L8下降24.6%。转录组分析鉴定出63个响应高氮处理的NAC基因。WGCNA将88个NAC基因分为4个共表达模块，其中蓝色模块与NUE相关性状关联最强。CsNAC3.16和CsNAC6.11被鉴定为该模块的枢纽基因，在氮处理期间于L2和L8间呈现差异表达模式。qRT–PCR分析进一步证实两个基因均响应高氮处理。CsNAC3.16在L2中的诱导强于L8，而CsNAC6.11在L2中强烈诱导但在L8处理后期表达降低。若干预测互作基因在高氮条件下也呈现基因型间差异表达。此外，蛋白互作预测提示CsNAC6.11与CsNAC1.8之间存在潜在互作。综上，这些结果为黄瓜NAC家族提供了更新的全基因组特征描述，并鉴定CsNAC3.16和CsNAC6.11为潜在与黄瓜氮响应及NUE相关性状相关的候选基因。
研究背景方面，氮是农业生产中限制作物生长和产量的关键因素，是蛋白质、核酸、酶辅因子和次生代谢物的主要成分，对植物生长发育至关重要。黄瓜是需氮量高的广泛栽培蔬菜作物，但近年来中国过量施用氮肥导致植株生长受限、NUE降低和果实产量下降。NAC（NAM-ATAF1/2-CUC2）基因家族是参与植物生长发育和胁迫响应的重要转录因子，近期发现其与植物NUE密切相关：大豆SNAP1/2/3/4在高氮下控制早期根瘤衰老并降低固氮酶活性从而降低NUE；GmNAC018和GmNAC039激活GmCYP35/GmCYP37促进根瘤衰老；水稻OsSNAC1通过上调OsNRT2.1/2.2和OsNRT1.1A/1.1B增强NUE；小麦TaNAC2-5A过表达增强根系生长和硝酸盐流入速率；苹果MdNAC4在低氮下提高ABA水平促进叶片衰老降低氮吸收利用效率；MhNAC1调控高亲和力氮转运蛋白MhNRT2.4减少低氮下根系氮吸收能力。然而，黄瓜NAC基因家族在NUE中的功能尚未系统研究。此外，Liu等人在黄瓜V2基因组中鉴定91个NAC基因，Guan等人将黄瓜基因组升级至V4（319 Mb，超过V2的193 Mb的1.5倍），Liu等人鉴定的91个基因中仅75个能准确定位到V4基因组，且V2/V3基因组编码区存在显著不准确。黄瓜全基因组关联研究显示全株干重与NUE强相关（r = 0.834），支持以生物量相关性状作为NUE性能指标。研究人员前期鉴定出高氮下NUE表型相反的兩個品系——高NUE品系L2和低NUE品系L8。本研究利用黄瓜V4基因组和黄瓜多组学数据库公开转录组数据，系统重新鉴定和表征黄瓜NAC基因家族，并进行表达谱分析和WGCNA以鉴定与高氮响应和NUE相关性状相关的NAC基因，为未来黄瓜氮响应和NUE功能研究提供更新基因组资源和候选基因。
研究人员开展的研究及结论：基于V4基因组鉴定出88个NAC基因，分为6个亚家族；启动子分析揭示大量胁迫、激素和生长发育相关顺式元件；转录组显示NAC基因主要在根中表达，62.5%成员共表达；高氮下L2全株干重增加25.6%而L8下降24.6%；鉴定63个高氮响应NAC基因；WGCNA分4个模块，蓝色模块与NUE关联最强（r = 0.57），CsNAC3.16和CsNAC6.11为枢纽基因且在两品系间差异表达；qRT–PCR证实两基因响应高氮；蛋白互作预测提示CsNAC6.11与CsNAC1.8潜在互作。重要意义在于提供了黄瓜NAC家族更新基因组特征并鉴定CsNAC3.16和CsNAC6.11为氮响应和NUE相关候选基因。
关键技术方法：研究人员从Cucumber-DB获取黄瓜基因组和转录组数据（高氮处理RNA-seq数据存于SRA登录号PRJNA1175851），从TAIR获取拟南芥蛋白序列；用HMMER 3.0以NAM结构域（PF02365）鉴定家族成员；用MEGA11最大似然法（1,000次bootstrap）构建系统发育树；用MEME鉴定保守基序、GSDS分析基因结构、PlantCARE分析启动子顺式元件；用TBtools进行染色体定位和共线性分析；用edgeR进行差异表达分析；用WGCNA构建共表达网络；以高NUE品系L2和低NUE品系L8进行水培高氮处理（20 mmol L?1硝酸盐）并测定干重；用STRING和AlphaFold3进行蛋白互作预测；用qRT–PCR（2?ΔΔC?法，EF1α为内参）验证表达。
研究结果：第一，NAC家族成员鉴定与系统发育分析——鉴定出88个NAC基因家族成员，基于蛋白序列构建系统发育树分为NAC-I至NAC-VI六个亚家族，NAC-I和NAC-II各含26个成员最多，NAC-VI仅含1个基因。第二，CsNAC基因染色体与亚细胞定位——88个基因在7条染色体上呈异质分布，Chr6最多（18个），Chr2最少（8个）；亚细胞定位预测61个基因定位于细胞核，9个定位于叶绿体，其余分布于细胞质、过氧化物酶体、线粒体、高尔基体、细胞骨架、质膜和液泡膜。第三，CsNAC基因家族比较共线性分析——黄瓜88个NAC基因中54个与拟南芥同源，70个与西瓜同源（同源性高达79.55%），64个与甜瓜同源，染色体高密度区基因在四物种间高度保守。第四，CsNAC基因家族结构与序列分析——鉴定10个保守基序，同一亚家族成员基序和结构域相似；启动子区富含光响应元件及水杨酸、脱落酸、茉莉酸甲酯响应元件等胁迫相关元件，以及醇溶蛋白代谢和昼夜节律相关元件。第五，CsNAC基因在植物组织中的表达相关性分析——88个CsNAC基因中9个在所有采样组织不表达，55个基因强互作（相关系数>0.7），73个基因主要在根中表达，66个在茎中、62个在果实中显著表达。第六，高氮处理下HNUE L2和LNUE L8的生物量积累——正常氮下L2全株干重2.841 ± 0.051 g高于L8的2.356 ± 0.176 g；高氮下L2全株干重增至3.569 ± 0.348 g（增加25.6%），L8降至1.777 ± 0.084 g（下降24.6%），茎、根、叶干重呈相同趋势。第七，WGCNA鉴定基因共表达模块及模块与NUE相关性——基于7个时间点（0、2、4、8、12、24、30 h）根系转录组数据鉴定4个模块（蓝色24个基因、棕色10个、灰色11个、蓝绿色32个），蓝色模块与NUE相关性最强（相关系数0.57）。第八，蓝色模块综合分析——蓝色模块24个基因中18个至少在一個品系特定时间点响应高氮，高NUE品系在8 h有11个基因响应、30 h有12个基因响应，低NUE品系24 h仅6个基因响应；CsNAC3.16和CsNAC6.11在五个时间点差异表达。第九，CsNAC3.16和CsNAC6.11蛋白互作网络预测——CsNAC3.16预测5个互作蛋白（含Aux/IAA家族、GRAS家族、TCP结构域蛋白等），功能富集于DNA结合转录因子活性和转录调控；CsNAC6.11预测5个互作蛋白，其中CsaV4_1G001338为CsNAC1.8，AlphaFold3预测两者可能互作（ipTM 0.66，pTM 0.65）并鉴定潜在氢键位点。第十，高氮下CsNAC3.16及其预测互作基因表达模式——qRT–PCR显示CsNAC3.16在L2中3 h增加约8.6倍、48 h增加约25倍，在L8中3 h增加约6–7倍、48 h增加约10倍，L2诱导水平始终高于L8；CsaV4_3G001730和CsaV4_3G002564在两基因型中持续下调。第十一，高氮下CsNAC6.11及其预测互作基因表达模式——CsNAC6.11在L2中3 h增至约2倍、48 h增至11倍以上，而在L8中3 h仅轻微变化、48 h降至约0.55倍；CsaV4_3G000946和CsaV4_6G003085在两基因型中持续下调。
讨论部分总结：本研究利用更全面的V4基因组（319 Mb）重新鉴定NAC基因家族，与Liu等人鉴定的91个基因不同，本研究仅检测到88个，仅72个基因重叠；差异源于Liu研究中部分基因在V4中合并为单一基因（23个基因合并为10个），部分基因重注释后被排除，部分基因在V4中缺乏完整基因结构，凸显V4基因组注释改进及重新鉴定的必要性。染色体定位显示许多NAC基因位于染色体末端附近，高重组率可能促进新基因形成和功能分化；亚细胞定位以核为主与Liu等一致，但定位多样性反映功能复杂性；共线性分析鉴定黄瓜与拟南芥54个同源基因（Liu等为39个），与西瓜70个、与甜瓜64个，表明葫芦科内进化分歧较低；基序分析与Liu等一致，鉴定NAC蛋白典型基序包括A–E亚结构域；顺式元件中水杨酸和茉莉酸甲酯参与胁迫响应，脱落酸可能在NUE中起重要调控作用。NAC基因家族已在多种作物中参与氮吸收、转运和利用调控，本研究通过高氮转录组数据分析其是否参与黄瓜氮响应过程；生物量测定验证两品系氮响应表型相反，支持L2和L8作为高、低NUE材料用于后续转录组分析；根是氮吸收主要器官，83% NAC家族成员在根中表达，可能参与初级氮响应和转运；88个NAC基因中77个表达，与Guan等报道73个接近；63个NAC基因响应高氮处理；CsNAC3.16和CsNAC6.11在五个时间点差异表达而多数其他基因少于三个时间点，WGCNA将两者归入与NUE关联最强的蓝色模块，提示其为重要氮响应候选基因；qRT–PCR验证两者响应高氮，CsNAC6.11在处理前两品系表达相似但处理后尤其是后期出现分歧，CsNAC3.16在处理前即存在组成型差异，提示影响基础表达的遗传变异可能贡献两品系氮响应差异；蛋白互作网络分析中CsNAC3.16互作网络涉及生长发育相关蛋白包括Aux/IAA家族生长素响应蛋白，CsNAC6.11预测互作蛋白包括NAC家族成员CsNAC1.8，AlphaFold3结构预测提示可能互作但需酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）等实验验证；研究局限在于CsNAC3.16和CsNAC6.11生物学功能主要从转录组、共表达网络、表达验证和计算预测推断，缺乏直接功能证据，未来需基因过表达、敲除或基因组编辑研究其具体作用。
研究结论翻译：本研究利用黄瓜V4参考基因组系统重新鉴定和表征了NAC转录因子家族，共鉴定88个CsNAC基因并分析其进化关系、基因结构、保守基序、染色体分布、顺式调控元件及不同组织表达谱。通过整合转录组分析、WGCNA、生物量评估和qRT-PCR验证，鉴定CsNAC3.16和CsNAC6.11为氮响应NAC基因，在高氮条件下于高、低NUE黄瓜品系间呈现差异表达模式。这些结果提示两个基因可能与氮响应过程相关，是未来NUE调控研究的有前景候选基因。尽管蛋白互作预测提示CsNAC6.11与CsNAC1.8之间存在潜在关联，但需实验验证以确定该互作是否在体内发生及其是否参与氮响应。综上，本研究为黄瓜NAC家族研究提供了更新基因组资源，并为未来阐明氮利用效率分子机制的功能研究奠定了基础。
