田间条件下小麦抗赤霉病相关组成型次生代谢物积累的代谢组学特征解析

《Current Plant Biology》：Metabolomic profiling reveals constitutive secondary metabolite accumulation associated with Fusarium head blight resistance in wheat under field conditions

　　

：赤霉病(FHB)主要由镰刀菌属物种（如禾谷镰刀菌）引起，对全球小麦生产构成严重威胁。为解析田间条件下抗性相关代谢性状，研究人员对感病品种Harukirari、抗病近等基因系(NIL)Kitamiharu-73及抗性供体亲本Sumai-3的穗部组织进行了非靶向代谢组学分析。样本分别在接种前及田间接种禾谷镰刀菌后28天(dpi)采集。主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)显示，未接种条件下Kitamiharu-73的基础代谢组介于Harukirari与Sumai-3之间，而接种后各基因型代谢谱趋于收敛。在未接种条件下，两个抗性基因型中共有228种代谢物显著高于感病品种，其中类黄酮为最富集的化学类别。接种后，共有上调代谢物降至72种，但类黄酮仍是最显著富集的类别。代表性代谢物分析显示，抗性基因型中异牡荆素(isovitexin)基础水平显著较高，而芦丁(rutin)和山奈酚-3-葡萄糖苷-3''-鼠李糖苷在接种后强烈诱导。抗性基因型还表现出较高的基础哌啶酸(pipecolic acid)、还原型谷胱甘肽(GSH)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)水平，并在接种后被消耗。在籽粒灌浆期，抗性基因型维持了更稳定的碳水化合物和核苷酸代谢稳态。研究结果表明，从Sumai-3导入的抗性背景与组成型代谢预激相关，特别是类黄酮等免疫相关代谢物的基础积累，这可能在病原胁迫下籽粒灌浆期间赋予生理优势。组成型积累的类黄酮相关代谢物可作为未来验证抗性相关代谢性状的候选标志物。

论文解读

一、研究背景与科学问题

赤霉病(Fusarium head blight, FHB)主要由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)等镰刀菌属真菌引起，是全球小麦生产面临的严重威胁，不仅造成产量损失，还导致脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)等B型单端孢霉烯族毒素在籽粒中积累，对人类和牲畜健康构成风险。传统防治策略如杀菌剂施用和轮作在病害流行条件下效果有限，因此遗传抗性被视为最有效且可持续的防治途径。然而，尽管抗性育种已取得进展，培育兼具强抗性和优良农艺性状的品种仍是重大挑战。中国地方品种苏麦3号(Sumai-3)具有特征明确的抗性并被广泛用作育种亲本，但其抗性导入常伴随连锁累赘，对产量和籽粒品质产生不利影响。

赤霉病抗性是由多个数量性状位点(quantitative trait loci, QTLs)调控的数量遗传性状，其中Fhb1和Fhb2是来自Sumai-3、在抗性育种中应用最广泛的QTLs。然而，这些导入的抗性区域如何在田间农艺条件下反映到下游代谢性状，目前仍缺乏充分理解。此前关于小麦赤霉病抗性的代谢组学研究多在受控条件下进行，田间条件下抗性相关化学响应及其贡献程度尚不明确。因此，本研究旨在解析田间病害压力下，经育种程序充分鉴定的抗性QTLs与下游代谢性状之间的关联。

二、研究内容与主要结论

研究人员以日本优良品种Harukirari为遗传背景，通过将Sumai-3的抗性QTLs回交导入，育成近等基因系(near-isogenic line, NIL)Kitamiharu-73。该品系在保留Harukirari优良农艺性状（早熟、良好籽粒品质）的同时，表现出增强的田间赤霉病抗性。研究人员对Harukirari、Sumai-3和Kitamiharu-73三个基因型的穗部组织进行了非靶向代谢组学分析，样本分别在田间接种禾谷镰刀菌前及接种后28天(dpi)采集。这一时间点对应籽粒灌浆（面团期）阶段，是决定粒重和品质的关键时期，用于评估病害压力下抗性和感病基因型的晚期代谢状态及其维持代谢稳态的能力。

研究结果表明，从Sumai-3导入的抗性背景与组成型代谢预激相关，特别是类黄酮等免疫相关代谢物的基础积累。这种代谢状态可能在病原胁迫下的籽粒灌浆期间赋予生理优势。感病品种表现出明显的代谢紊乱，而抗性基因型维持了更稳定的碳水化合物和核苷酸稳态。组成型积累的类黄酮相关代谢物可作为未来验证抗性相关代谢性状的候选标志物。

三、关键技术方法

本研究主要采用以下关键技术方法：以日本Kitami农业试验站田间试验为基础，选用高致病性禾谷镰刀菌菌株TYK101-1（产DON化学型）进行喷雾接种；采用超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)技术对小麦穗部组织进行非靶向代谢组学分析，使用Q Exactive Plus Orbitrap质谱仪在正负离子模式下采集数据；利用MS-DIAL v5.5.2软件进行峰检测和代谢物注释，依据代谢组学标准倡议(Metabolomics Standards Initiative, MSI)2-3级标准确定注释置信度；采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、富集分析和通路分析进行统计处理，使用MetaboAnalyst 6.0软件完成；代谢物分类采用ClassyFire工具，依据InChIKey进行归类。样本来源为三个小麦基因型（Harukirari、Kitamiharu-73、Sumai-3）在接种前和接种后28天的穗部组织，每个基因型各取10个穗进行代谢物提取。

四、研究结果

1. 1.
   全局代谢组学分析与基因型分化

通过PCA分析，未接种条件下Harukirari和Kitamiharu-73的代谢谱相似，而Sumai-3沿PC1明显分离，表明其具有独特的基础代谢组。接种后各基因型样本聚类更紧密，提示病原挑战下存在共享的代谢响应。PLS-DA分析显示，未接种条件下Kitamiharu-73与Harukirari清晰分离并位于Harukirari和Sumai-3之间，表明其基础代谢组兼具优良背景和抗性供体的特征。接种后各基因型代谢谱趋于一致，反映感染后收敛性响应以及该发育阶段籽粒成熟和衰老主导的生理程序。

1. 2.
   抗性基因型中类黄酮及其他次生代谢物的组成型积累

未接种条件下，与感病品种Harukirari相比，两个抗性品系（Sumai-3和Kitamiharu-73）中共有228种代谢物显著上调（倍数变化>1.2，p<0.05）。化学分类显示类黄酮为最富集的类别，其次为有机氧化合物、异戊二烯脂质和羧酸及其衍生物。富集分析确认类黄酮为最显著富集的类别。接种后，抗性品系共有上调代谢物降至72种，化学组成发生转变，异戊二烯脂质成为最丰富的类别，但类黄酮仍是最显著富集的类别（p<0.01），表明类黄酮通路是抗性相关代谢特征的核心且一致的组成部分。

1. 3.
   与抗性相关的苯丙烷类代谢特征

代表性代谢物分析显示，异牡荆素在未接种的抗性品系中基础水平显著高于感病品种。接种后，山奈酚-3-葡萄糖苷-3''-鼠李糖苷和芦丁在抗性基因型中强烈诱导，其中Sumai-3中芦丁水平在接种后达到感病对照的近15倍。上游前体分析显示，感病品种Harukirari中苯丙氨酸基础水平最高，而抗性品系维持低稳态水平，提示感病品种存在前体代谢瓶颈，抗性品系则能高效地将前体导入苯丙烷类通路。此前对Fhb2位点的遗传学研究提出4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)和碱性螺旋-环-螺旋转录因子等候选基因，与本研究观察到的苯丙烷类代谢通量差异一致。此外，牡荆素、表儿茶素和木犀草素在未接种的Sumai-3中基础水平极高，接种后急剧下降，可能反映病原挑战期间的消耗或代谢周转。

1. 4.
   信号传导、氧化还原调控及胁迫相关代谢物

哌啶酸作为系统获得抗性(systemic acquired resistance, SAR)的调控因子和N-羟基哌啶酸(NHP)的代谢前体，在Kitamiharu-73和Sumai-3中组成型高水平积累，而Harukirari中持续低水平，提示抗性基因型存在预激的SAR相关代谢状态。水杨酸在未接种的Sumai-3和Kitamiharu-73中显著高于Harukirari，Sumai-3的基础茉莉酸水平约为Harukirari的两倍。还原型谷胱甘肽在未接种的抗性基因型中基础水平较高，接种后显著消耗，与清除活性氧和DON相关胁迫的利用一致；而Harukirari基础谷胱甘肽水平低，仅在感染后升高，提示延迟且可能不足的胁迫响应。NAD在抗性品系中维持显著较高的基础水平并在防御响应中被消耗。烟酰胺单核苷酸(NMN)在未接种样本中均低，但仅在接种的Sumai-3中急剧升高，提示病原压力下NAD库的主动补充。

1. 5.
   病原压力下籽粒灌浆期的代谢稳态

抗性基因型中葡萄糖-6-磷酸(G6P)在未接种时维持高基础水平，接种后被大量消耗，可能为磷酸戊糖途径提供底物以生成NADPH。接种后28天（籽粒灌浆高峰期），所有基因型中D-葡萄糖均升高，Sumai-3维持最高绝对水平，可能反映抗性基因型在病害压力下更好地维持碳供应和代谢稳态。寡糖谱发生从储存到保护的转变：组成型储备的棉子糖系列寡糖（水苏糖和毛蕊花糖）在感染后下降，而棉子糖和肌醇被诱导，可能作为相容性溶质和抗氧化剂稳定膜结构。嘌呤代谢方面，鸟嘌呤在未接种的Sumai-3中高并在接种后消耗，而Harukirari在接种后积累鸟嘌呤，可能反映病害胁迫下的代谢失调和组织损伤；Kitamiharu-73避免了这种胁迫诱导的积累并维持稳定鸟嘌呤水平。6-甲基腺苷(m6A)在Sumai-3中显示高组成型水平，而Kitamiharu-73在接种后显著诱导，可能涉及核苷酸/RNA周转或m6A相关调控过程。

1. 6.
   抗性相关代谢特征总结

与抗性供体Sumai-3相比，Harukirari和Kitamiharu-73共有的优良遗传背景在未接种条件下有342种代谢物富集，接种后仍有272种维持显著较高水平，主要由有机氧化合物、类黄酮和异戊二烯脂质组成，提示活跃的中心碳代谢支持产量形成所需的持续能量供给。类黄酮结构分类显示，抗性相关类黄酮（Kitamiharu-73和Sumai-3中积累）主要为糖苷形式，而优良背景相关类黄酮（Harukirari和Kitamiharu-73中积累）结构多样性更高，包括苷元及甲基化或异戊烯化形式。

五、讨论与结论

讨论部分指出，抗性相关类黄酮以糖苷为主的结构特征提示抗性依赖于可动员的水溶性潜在防御化合物库。优良背景中富集的类黄酮如山奈酚和芦丁苷曾被报道为生长素运输调节因子，对优化穗部结构和籽粒灌浆至关重要，这可能解释了Kitamiharu-73在获得抗性的同时保持优良农艺性状的代谢基础。研究同时指出，虽然多种已检测类黄酮属于此前报道具有抗真菌或毒素抑制活性的结构类别，但现有证据对类黄酮类别及相关化合物的支持强于对具体检测到的糖苷形式的支持，因此需要靶向定量和功能验证。

研究结论为：从Sumai-3导入的抗性背景与组成型代谢预激相关，特别是类黄酮及其他免疫相关代谢物的基础积累。这种代谢状态可能在病原胁迫下籽粒灌浆期间赋予生理优势。感病品种表现出明显的代谢紊乱，而抗性基因型维持了更稳定的碳水化合物和核苷酸稳态。这些结果共同表明，次生代谢物的组成型积累和代谢稳态的维持与田间条件下赤霉病抗性相关，支持次生代谢在小麦病害相关胁迫适应和植株适应性中的作用。组成型积累的类黄酮相关代谢物可作为未来验证抗性相关代谢性状的候选标志物。