牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡与人红细胞相互作用的蛋白质组学解析

《Current Research in Microbial Sciences》：Interaction of outer membrane vesicles of the oral pathogen Porphyromonas gingivalis with human red blood cells disclosed by proteome analyses

　　

牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）是一种关键的口腔病原菌，驱动牙周炎的发生发展。该菌的致病性依赖于多种毒力因子，这些因子通过胞质输出后，或锚定于细菌外膜，或以可溶形式分泌，或被分选进入释放至胞外环境的外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs）中。本研究首次定义了P. gingivalis OMV核心蛋白质组，揭示了T9SS（Type IX secretion system）组分的存在是OMV的保守特征，并证实肽基精氨酸脱亚氨酶PPAD（peptidyl-arginine deiminase）可影响OMV货物蛋白的组成。研究还发现P. gingivalis OMVs在血红素和铁获取中具有多种潜在作用，并能够触发人红细胞的凝集（hemagglutination）与溶血（hemolysis）。通过比较蛋白质组学分析，研究人员鉴定了来自PPAD分型I型和II型菌株及PPAD缺陷突变体的OMV蛋白组成差异，并在体外实验中证实OMVs与人红细胞（red blood cells, RBCs）的直接相互作用，为理解该病原菌经血行播散及系统性疾病关联提供了新的机制见解。

一、研究背景与科学问题

牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）是牙周炎的关键口腔病原菌，同时与类风湿关节炎和阿尔茨海默病等多种炎症性及退行性疾病密切相关。该菌的致病性依赖于多种毒力因子，包括牙龈素（gingipains，即RgpA/RgpB和Kgp）和肽基精氨酸脱亚氨酶（PPAD），这些因子通过T9SS分泌系统（Type IX secretion system）输出至外膜或胞外环境。P. gingivalis产生平均直径约120 nm的外膜囊泡（OMVs），这些OMVs富含蛋白类毒力因子，可作为靶向先天性和适应性免疫细胞的递送载体，并可通过血行播散到达包括大脑在内的远处部位，甚至穿越血脑屏障。然而，目前对OMVs与人红细胞（RBCs）的相互作用研究极为有限，仅有一项针对绵羊红细胞的研究报道了OMV相关菌毛样脂蛋白PG1881介导的红细胞结合与聚集。此外，既往OMV蛋白质组研究多集中于参考菌株，缺乏对临床分离株的系统性分析。因此，本研究旨在：(i) 对P. gingivalis参考菌株和PPAD分型I型及II型临床分离株的OMV蛋白货物进行全面表征；(ii) 比较PPAD功能正常与缺陷菌株的OMV蛋白质组差异；(iii) 在体外研究不同菌株OMVs与人红细胞的相互作用，重点关注凝集与溶血效应。

二、研究内容与主要结论

研究人员对P. gingivalis W83和ATCC 33277参考菌株、相应PPAD缺失突变体（W83ΔPPAD和ATCCΔPPAD）以及两株PPAD分型II型临床分离株（505759和512915）的OMV蛋白质组进行了系统分析。共鉴定出各菌株OMV中101至203种蛋白质，其中23种T9SS相关货物蛋白在所有菌株OMV中均被鉴定到，约占各菌株T9SS相关货物蛋白总数的75%，表明T9SS货物蛋白的存在是P. gingivalis OMV的保守特征。值得注意的是，在所有OMV中均鉴定到T9SS附着复合物的四个组分（PorQ、PorU、PorV和PorZ），而W83菌株的OMV中检测到了几乎所有已知的T9SS组分。PPAD缺失导致W83菌株OMV中PorE、PorF、PorG和PorP等T9SS组分缺失，但Western blotting分析显示RgpA和RgpB在PPAD功能正常与缺陷菌株的OMV中含量相当，提示PPAD可能通过影响T9SS组分装配来调节牙龈素的精氨酸特异性活性。此外，研究首次定义了P. gingivalis OMV核心蛋白质组，并发现OMVs中富含与血红素和铁获取相关的蛋白，提示其在营养获取中的潜在作用。体外功能实验表明，P. gingivalis OMVs能够以浓度依赖方式诱导人红细胞凝集和溶血，且不同菌株来源的OMV溶血活性存在显著差异。

三、关键技术与方法

本研究采用的主要技术方法包括：利用碘克沙醇（Optiprep?）密度梯度离心从培养上清中纯化P. gingivalis OMVs；通过纳米颗粒追踪分析（NTA）对OMV的粒径、Zeta电位和颗粒浓度进行表征；采用凝胶电泳预分离结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行无标记定量蛋白质组学分析；使用MaxQuant和Perseus软件进行蛋白质鉴定和定量，并应用OrthoFinder构建跨菌株直系同源群；通过LDS-PAGE和Western blotting验证关键蛋白（Omp41、Kgp、RgpA/B和PPAD）的OMV关联性；采用人A型红细胞进行体外血凝和溶血实验，血凝实验以凝集滴度（HaT）为终点，溶血实验以OD₄₁₀吸光度定量溶血百分比并计算HEC₅₀值。血液样本来自健康志愿者，经格罗宁根大学医学中心医学伦理委员会批准。

四、研究结果

4.1 OMV表征、蛋白鉴定及与参考数据库的比较

通过NTA分析，各菌株OMV粒径介于100.85至120.67 nm之间，Zeta电位介于?47.07至?38.58 mV之间，100 μg/mL总蛋白的OMV储备液中颗粒浓度为3.70×10¹¹至4.72×10¹² particles/mL。各菌株OMV中鉴定到的蛋白质数量为101至203种，其中ATCC 33277菌株OMV蛋白复杂度最低，而W83和临床分离株的OMV具有更高的蛋白质组和功能复杂度。与既往研究相比，本研究鉴定到的蛋白数量与Veith等人在W50菌株中报道的151至180种蛋白更为接近，差异可能源于OMV纯化方法、样品制备和质谱分析的差异。

4.2 预测亚细胞定位

预测亚细胞定位分析显示，所有菌株OMV中约70%的蛋白为外膜和周质蛋白。ATCC 33277及其PPAD缺失突变体的OMV中内膜和胞质蛋白仅占约8%，而其他菌株约为20%。在OMV中鉴定到GAPDH、4-羟基丁酰-CoA脱水酶和NAD特异性谷氨酸脱氢酶等胞质蛋白，与Veith等人报道的moonlighting蛋白现象一致。W83菌株（无荚膜菌毛）OMV中胞质蛋白含量高于有菌毛的ATCC 33277菌株，可能与菌毛对细胞包膜完整性的维持作用有关。

4.3 T9SS相关OMV货物蛋白的高丰度及附着复合物的保守存在

在所有菌株OMV中均鉴定到23种T9SS相关货物蛋白，包括RgpA、RgpB、Kgp、PPAD、HagA、PorA、PorU等。所有33种已知T9SS货物蛋白均在本研究分析的OMV中有所覆盖，但仅23种为所有菌株共有。Western blotting验证了Kgp、RgpA/B和Omp41在所有OMV中的存在，PPAD仅在PPAD功能正常菌株中检测到。PPAD分型I型菌株呈现75–85 kDa的PPAD特异性条带，而分型II型临床分离株呈现47 kDa和37 kDa两条特征性条带。T9SS附着复合物（PorQ、PorU、PorV和PorZ）在所有OMV中均被鉴定到，而W83菌株OMV中检测到几乎所有T9SS组分，但PPAD缺失导致PorE、PorF、PorG和PorP的缺失。

4.4 PPAD对OMV货物组成的影响

比较蛋白质组学分析显示，PPAD缺失对W83和ATCC 33277菌株OMV蛋白组成均有显著影响。在W83ΔPPAD的OMV中，T9SS组分PorE、PorF、PorG和PorP缺失，而在PPAD功能正常的W83菌株中这些组分存在。鉴于PorF此前被报道为牙龈素生物发生所必需，这一发现提示PPAD可能通过影响T9SS组分的包装来调节牙龈素的精氨酸特异性活性，尽管RgpA和RgpB的蛋白量在PPAD缺陷菌株中并未减少。

4.5 OMVs与人红细胞的相互作用

血凝实验表明，P. gingivalis OMVs能以浓度依赖方式诱导人红细胞凝集，凝集滴度（HaT）在2.5至0.005 μg/mL浓度范围内可检测。溶血实验显示，OMVs在25至3.25 μg/mL浓度范围内诱导人红细胞溶血，溶血百分比随OMV浓度增加而升高，不同菌株来源的OMV溶血活性存在显著差异（p≤0.05），并通过线性回归确定了各菌株的HEC₅₀值。

五、讨论与结论

本研究首次定义了P. gingivalis OMV核心蛋白质组，证实T9SS相关货物蛋白和附着复合物是OMV的保守特征。OMVs中富含与血红素和铁获取相关的蛋白，提示其在营养获取中的多种潜在作用。PPAD不仅影响OMV的货物组成，还通过影响T9SS组分包装间接调节牙龈素活性。体外实验证实P. gingivalis OMVs能够诱导人红细胞凝集和溶血，提示红细胞可能作为OMVs在体内播散的运输载体，这一发现为理解P. gingivalis经血行播散及其与全身性疾病（如类风湿关节炎和阿尔茨海默病）的关联提供了新的机制线索。研究结论表明，P. gingivalis OMVs具有菌株特异性的蛋白质组特征和功能多样性，其与人红细胞的相互作用可能构成该病原菌系统性传播的重要途径。