Oya病毒（OYAV）反向遗传学与报告病毒系统的建立及其在蚊源细胞中高通量筛选病毒复制抑制剂中的应用

《mSphere》：Oya virus reporter systems for high-throughput screening of viral replication inhibitors in mosquito cells

　　

正布尼亚病毒（Orthobunyavirus）是一类多样化的虫媒病毒，然而基于报告病毒的抑制剂在蚊源细胞中的筛选仍未得到充分探索。Oya病毒（OYAV）是一种在人类、蚊和蠓中检测到的Simbu血清群正布尼亚病毒，目前缺乏反向遗传学工具和定量化合物筛选平台。在本研究中，研究人员建立了首个基于质粒的OYAV反向遗传学系统，成功拯救了重组野生型病毒（rOYAV/WT）以及表达增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, eGFP）的rOYAV/eGFP/S或mCherry的rOYAV/mCherry/S报告病毒。两种报告病毒在多种脊椎动物和蚊源细胞系中均保持稳定的报告基因表达和感染性，不过报告基因插入导致其复制能力较亲本病毒减弱。利用强荧光信号以及连续传代过程中报告基因区段的保留，研究人员建立了一种基于蚊细胞的高内涵筛选平台，用于在C6/36细胞中鉴定抑制OYAV复制的化合物。该检测体系表现出高稳健性和可重复性，Z′因子为0.755，并且与野生型病毒的复制谱高度相关。通过对含800种化合物的文库进行筛选，研究人员鉴定出10个对OYAV复制具有>95%抑制活性的候选物。其中，柴胡皂苷B2（saikosaponin B2）、芬戈莫德（盐酸盐）[fingolimod (hydrochloride)]和防己诺林碱（fangchinoline）在微摩尔浓度下对报告病毒和野生型OYAV复制均表现出抑制作用，且对C6/36细胞的细胞毒性有限。总之，本研究建立了OYAV反向遗传学系统以及基于蚊细胞的定量正布尼亚病毒复制抑制剂筛选平台，为研究OYAV复制和在蚊源细胞中评估抗病毒化合物提供了有价值的工具。

正布尼亚病毒（Orthobunyavirus）属于布尼亚病毒目（Bunyavirales）周布尼亚病毒科（Peribunyaviridae），是广泛分布的虫媒病毒，可引起人类发热性疾病、脑炎、出血性疾病及家畜生殖障碍。2023至2025年间Oropouche病毒（OROV）在美洲和加勒比地区暴发并出现严重神经与出血表现，凸显了正布尼亚病毒的流行潜力。然而多数正布尼亚病毒尚无特异性疫苗和抗病毒药物。Oya病毒（OYAV）是Simbu血清群成员，已在亚洲人群、蚊和蠓中检出，且有直接临床证据表明其可导致人类严重肝炎、肠炎和凝血病。虫媒病毒传播依赖于在脊椎动物宿主和节肢动物媒介间的交替复制，因此必须在两类细胞体系中进行研究。但OYAV此前缺乏反向遗传学系统和报告病毒，也未有正布尼亚病毒报告系统用于蚊源细胞定量抑制剂筛选的报道。为此，研究人员建立了首个OYAV反向遗传学系统，生成荧光报告病毒，并开发了基于蚊细胞的高通量抑制剂筛选平台。

研究人员基于已建立的Ebinur湖病毒（EBIV）感染性克隆策略，将分离自中国云南省蠓（Culicoides midges）的OYAV SZC50株S、M、L三个节段全长cDNA克隆至pLCK载体，在BSR-T7/5细胞中共转染，成功拯救出重组野生型病毒rOYAV/WT，以及将eGFP或mCherry基因通过猪提申病毒1型2A肽（P2A）插入S节段的报告病毒rOYAV/eGFP/S和rOYAV/mCherry/S。生长动力学显示报告病毒复制滴度低于野生型，但在C6/36和BHK-21细胞中连续传代5次后仍保留报告基因和荧光表达。间接免疫荧光（IFA）证实重组病毒在Huh7、Vero E6、PK15、LMH、BHK-21和C6/36等细胞中均具感染性。利用rOYAV/eGFP/S，研究人员在C6/36细胞中优化了高内涵筛选（high-content screening）条件，以利巴韦林为阳性对照进行验证，获得Z′因子0.755。从800种化合物库中筛选出10个抑制率≥95%的候选物，其中柴胡皂苷B2（saikosaponin B2）、芬戈莫德（盐酸盐）[fingolimod (hydrochloride)]和防己诺林碱（fangchinoline）在微摩尔浓度下对报告病毒和野生型OYAV均有效，且细胞毒性较低。

主要关键技术方法包括：基于EBIV感染性克隆策略，将OYAV S/M/L节段全长cDNA克隆至pLCK载体并在BSR-T7/5细胞中拯救；采用P2A自裂解肽将eGFP或mCherry插入S节段构建报告病毒；利用C6/36细胞（来源于白纹伊蚊Aedes albopictus）建立高内涵成像筛选平台；以利巴韦林为阳性对照进行验证；使用MedChemExpress（MCE）的800种化合物库进行初筛，并通过反转录-实时定量PCR（RT-qPCR）和CCK-8法测定半数有效浓度（EC₅₀）、半数细胞毒性浓度（CC₅₀）及选择性指数（selectivity index, SI）。

重组病毒的拯救与特征鉴定。通过反向遗传学在BSR-T7/5细胞中拯救出三种重组病毒。rOYAV/WT在转染后2天出现细胞病变（CPE），报告病毒则延迟至5天，但荧光信号在2天即可检出。空斑实验显示报告病毒空斑面积显著小于rOYAV/WT，提示报告基因插入降低了复制效率。

报告基因表达及插入片段在连续传代中的稳定性。在C6/36和BHK-21细胞中将rOYAV/eGFP/S和rOYAV/mCherry/S连续盲传5代（P1–P5），荧光信号持续可检；RT-PCR检测到含报告基因的预期大小扩增片段，未出现野生型大小片段，表明报告基因区段稳定保留。在C6/36细胞中，两种报告病毒P2–P5的感染滴度维持在约10⁵ 空斑形成单位（PFU）/mL。

重组OYAV的体外细胞敏感性和感染性。用IFA检测OYAV核蛋白（NP）表达，发现三种重组病毒均能感染Huh7、Vero E6、PK15、LMH、BHK-21和C6/36等测试细胞系，且荧光蛋白插入未改变病毒对多种物种来源细胞的感染范围。

基于OYAV-eGFP的高通量筛选平台的建立与验证。通过比较感染复数（MOI）0.1和0.01在48和72 hpi的信号，选定MOI=0.1、72 hpi为最优条件。利巴韦林剂量反应实验中，rOYAV/eGFP/S的EC₅₀为2.026 μM，与OYAV/WT的1.404 μM接近，验证报告病毒可反映野生型病毒的抗病毒敏感性。eGFP系统Z′因子为0.755，优于mCherry系统的0.574，且均超过高通量筛选可靠阈值0.5。

抗OYAV候选化合物的鉴定与二次验证。从800个化合物中初筛出10个抑制率≥95%且细胞活力>70%的候选物。经剂量反应验证，saikosaponin B2、fingolimod (hydrochloride)和fangchinoline对rOYAV/eGFP/S的EC₅₀分别为4.305、8.357和4.152 μM，对OYAV/WT的EC₅₀分别为8.013、2.603和4.329 μM；对应的SI分别为30.801、4.500和3.952。在有效浓度下细胞活力均保持在70%以上，表明其抑制作用具有选择性。

讨论部分指出，本研究首次为OYAV提供反向遗传学平台，扩展了正布尼亚病毒的分子工具。报告病毒复制衰减与外源基因插入对基因组包装或转录复制的限制有关。rOYAV/eGFP/S对利巴韦林的响应与野生型一致，表明其可可靠用于抗病毒评价。尽管所用化合物库主要针对哺乳动物抗病毒通路设计，筛选仍获得了在蚊源细胞中活性较好的候选物，其中saikosaponin B2选择性指数最高。该研究也承认C6/36细胞存在RNA干扰和天然免疫缺陷，且报告病毒复制减弱可能影响筛选灵敏度，需在更接近体内环境的蚊模型和哺乳动物系统中进一步验证。

总之，研究人员成功建立了首个基于质粒的OYAV反向遗传学系统，并生成了可稳定传代5次的荧光报告病毒。利用该平台，研究人员进一步建立了稳健的蚊源细胞高通量病毒抑制剂筛选系统，鉴定出具有强抑制活性的抗OYAV候选化合物。该研究不仅为研究OYAV生物学、病毒基因功能和病毒-宿主互作提供了重要的分子工具，还提出了一种以媒介为导向的抑制剂发现策略，补充了传统以脊椎动物宿主为重点的方法。这些发现为正布尼亚病毒研究提供了通用实验框架，并支持开发旨在媒介水平阻断虫媒病毒传播的新干预策略。