《European Journal of Medicinal Chemistry》：HDAC3 Degradation to Uncover Therapeutic Vulnerability in Colorectal Cancer
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结直肠癌（CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，约占全部癌症诊断的10%，是癌症相关死亡的第二大原因。尽管筛查和治疗方案不断进步，晚期或转移性CRC患者的预后仍然较差，主要归因于对标准治疗（如5-氟尿嘧啶（5-FU）、西妥昔单抗）的耐药。肿瘤发生源于遗传突变和表
结直肠癌（CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，约占全部癌症诊断的10%，是癌症相关死亡的第二大原因。尽管筛查和治疗方案不断进步，晚期或转移性CRC患者的预后仍然较差，主要归因于对标准治疗（如5-氟尿嘧啶（5-FU）、西妥昔单抗）的耐药。肿瘤发生源于遗传突变和表观遗传失调，包括DNA甲基化改变、组蛋白修饰和microRNA表达异常。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）通过去除组蛋白赖氨酸残基上的乙酰基，导致染色质浓缩和转录抑制，在增殖、分化和凋亡等细胞过程中发挥关键作用。在CRC中，核内I类HDACs常过度表达，与患者生存率低相关；HDAC3被鉴定为人CRC肿瘤中过度表达最显著的I类HDAC，其基因沉默可导致生长抑制和凋亡，并伴随p21表达增加。尽管HDAC抑制剂（HDACis）如entinostat显示出治疗潜力，但其临床效用常受副作用、耐药和复发限制。蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）通过同时招募靶蛋白（POI）和E3连接酶（如VHL或CRBN），诱导多泛素化及蛋白酶体降解，提供了一种可调控的表观遗传网络调节策略。研究人员以临床阶段HDACi entinostat（1）为先导，将其从占据驱动的配体转化为事件驱动的降解工具，设计并合成了一系列VHL和CRBN招募的HDAC靶向PROTACs（4a-h），通过体外和体内生物学研究（包括CRC细胞系、患者来源CRC类器官和CAM模型），全面评估其降解特性和治疗潜力。研究结果表明，化合物4b和4h优先降解HDAC3，该降解呈蛋白酶体依赖性；4b可降低患者来源CRC类器官的生长和干性标志物；两种降解剂在CRC CAM模型中均增加p21表达。该研究首次提供了双HDAC3降解剂在体外、体内及患者类器官中对抗CRC表观遗传易感性的证据，具有重要的转化意义。
**研究背景** 结直肠癌（CRC）发病率约占所有癌症的10%，死亡率居第二位，晚期患者预后差、耐药问题突出。肿瘤发生涉及遗传突变和表观遗传失调，组蛋白去乙酰化酶（HDACs）在染色质结构和基因表达调控中起核心作用。CRC中I类HDACs（尤其HDAC3）过度表达，与预后不良相关，HDAC3基因沉默可诱导生长抑制和凋亡并上调p21。尽管HDAC抑制剂（HDACis）如entinostat具治疗潜力，但受副作用、耐药和复发限制。蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）通过招募E3泛素连接酶（VHL或CRBN）诱导靶蛋白（POI）泛素化及蛋白酶体降解，具事件驱动药理学优势。既往I类HDAC PROTACs多以CI-994为POI配体，生物学评价局限于CRC细胞系抗增殖实验。本研究以entinostat为POI配体，构建VHL和CRBN两系列降解剂（4a-h），并在细胞、患者来源类器官和体内CAM模型中综合评价其治疗潜力。**主要技术方法** 研究人员采用分子建模（对接、metadynamics及分子动力学模拟）设计降解剂并理性化三元复合物；经化学合成获得4a-h；通过重组酶荧光法测定HDAC抑制活性；在HCT116、DLD1等细胞系及正常结肠上皮细胞（HCEC）中以Western Blot、结晶紫、流式细胞术（Annexin V/PI、细胞周期）评价降解与凋亡；采用MG132挽救实验验证蛋白酶体依赖性；使用患者来源CRC类器官（ISO49、ISO50、15640）及鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）HCT116移植模型进行体内外评价；并行HPLC测定溶解度与化学稳定性、人肝微粒体（HLM）代谢稳定性及代谢物鉴定。**研究结果** *分子建模研究与新HDAC降解剂的设计策略：确定可行的出口矢量* 研究人员将entinostat（1）对接于hHDAC3（PDB ID: 4A69），发现其氨基甲酸酯与I类HDAC高度保守的Asp93形成有效相互作用；末端吡啶环非HDAC抑制关键决定因素，其C6位酰氨基取代可朝溶剂方向延伸，适合连接linker，据此合成化合物5，并构建VHL（4a-e）与CRBN（4f-h）两系列降解剂。*化学* 经Scheme 1-3合成胺砌块5、13及目标化合物4a-h。*对代表性HDAC的体外抑制活性* 4a-h总体保留对I类HDAC的抑制活性，4a、4b（短linker）对HDAC1/3抑制增强（4b IC50 = 627/214 nM），对HDAC6/8活性弱；以Ac-spermidine-AMC底物测定时所有化合物对HDAC10的IC50 > 10,000 nM，提示肽底物法的局限；4b、4f、4g、4h对HDAC5和HDAC11无明显抑制。*HDACs降解与抗肿瘤潜力* 在HCT116细胞以25 μM处理后，4b诱导几乎完全的HDAC3降解，4c、4g、4h亦显著降低HDAC3水平，显示高降解特异性；4b、4g、4h诱导轻度HDAC1降解；4b、4d、4g、4h引起明显PARP剪切；所有化合物（除4f）诱导组蛋白H3乙酰化；HDAC6水平不受影响，HDAC11不变；所有化合物上调p21。4b与4h被选定为进一步研究对象，二者剂量依赖性降低细胞活力，而VH032和POM单用无此效应，且在HCEC细胞中未见细胞毒性。*4b和4h HDAC降解剂的机制研究* MG132（150 nM）共处理完全挽救HDAC3并稳定HDAC1，证实降解经泛素-蛋白酶体系统、呈蛋白酶体依赖性；在1-100 μM范围内未见明显hook效应。*通过分子建模理性化推定的HDAC3:PROTAC:VHL三元复合物* 对HDAC3:4b:VHL及HDAC3:4e:VHL的1 μs分子动力学模拟显示PROTAC两端持续结合各自位点，4b的VHL结合片段接触更稳定，且4b可能比4e形成更持久的HDAC3-VHL蛋白-蛋白接触（涉及VHL Arg69、Glu70、Gln73、Arg108等热点残基）；而HDAC3:4a:VHL模拟中VHL结合片段失去关键极性接触并从预测结合位点位移。*时间依赖性降解谱* 在HCT116中，4b处理72 h后HDAC1降解明显，HDAC3呈时间依赖性降解；4h主要在48 h后显著降低HDAC1；两化合物48和72 h均见PARP剪切，p21快速上调。在耐药DLD1细胞中，两化合物均不影响HDAC1和HDAC10水平，72 h HDAC3降解未反映于PARP剪切，提示降解活性具细胞系依赖性；在10种CRC细胞系中，两化合物细胞毒性差异明显，与TP53、PIK3CA、KRAS或BRAF等驱动突变无明确关联，提示取决于整体遗传背景、表观遗传景观或基础HDAC表达水平等复杂因素。*凋亡机制与细胞周期分布研究* Annexin V/PI显示4b显著增加HCT116早期凋亡细胞（32.2%），4h较弱（13.7%），DLD1中均不诱导凋亡；细胞周期分析显示sub-G1比例明显增加，S和G2/M期显著减少，G1期基本不变；Western Blot显示p21上调、Cyclin B1快速近乎完全丢失；MG132共处理恢复Cyclin B1水平并阻止p21诱导，消除G2/M检查点控制，提示HDAC降解部分通过表观遗传上调p21，与细胞周期检查点控制存在机制联系。*4b和4h在鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型中的体内疗效* 在HCT116 CAM模型中，卡尺测量的肿瘤体积在4b、4h与DMSO对照间无显著差异；胚胎及主要器官重量未受明显影响（4b组脾脏略增大），未见可测量的全身毒性；免疫组化显示4b和4h处理后p21阳性核显著增加，未见p21胞质再定位，提示具核内生长抑制功能。*患者来源类器官中的抗肿瘤疗效评价* 在ISO49、ISO50、15640三株患者来源CRC类器官中，4b处理组类器官生长延迟、体积明显减小，凋亡细胞主要位于基底侧；4h对生长形态影响不明显，但两化合物均增加PI阳性细胞比例。4b和4h处理后ISO50和15640的干性标志物LGR5和CD44表达显著下降，ISO49仅对4b显示LGR5降低；p21上调呈类器官系特异性但各系均可观察到，ISO50经4b处理后p21阳性细胞增幅最高。*4b和4h理化性质分析* 4b化学稳定性优（pH 3和7.4均约99.8%）但水溶性较低（logS约-6.0/-5.7）；4h溶解性较好但稳定性显著较低（pH 7.4为64.9%）。*肝脏代谢稳定性* 人肝微粒体孵育中4b半衰期约48.4 min、4h约17.2 min，分别归类为中等和高清除化合物（CLint为23.2和65.4 mL·min-1·kg-1）；代谢由CYP依赖的氧化途径介导；4b主要经N-脱烷基化、单羟化和水解代谢，无单一主导软点；4h主要经氧化N-脱烷基化代谢，N-烷基取代基为关键代谢软点，4h-M5为最丰富代谢物。**讨论与结论** 本研究提出HDAC3降解是CRC的潜在治疗策略。所设计的新型PROTACs经蛋白酶体依赖机制有效诱导稳健且优先的HDAC3降解，并经MG132挽救实验证实。先导化合物4b和4h在细胞实验中促进凋亡（PARP剪切）并上调p21，与细胞周期阻滞及G2/M进程受损一致，且在正常结肠上皮细胞中未见可检测的细胞毒性，安全性良好。在患者来源类器官和类体内CAM模型中显示的疗效凸显了HDAC3降解的转化相关性：类器官中显著降低干性标志物LGR5和CD44，体内4b、4h诱导p21稳健积累，克服CRC表观遗传易感性。总之，研究结果首次报道了在体外、体内及CRC患者类器官中均有效的双HDAC3降解剂，用以对抗CRC的表观遗传易感性。
