《Food Bioscience》：Enhanced Cytoprotective Potential of a Food-Compatible Quercetin Oxidation Metabolite
编辑推荐：
槲皮素的一种氧化代谢产物BZF通过一种食品相容的方法合成。与槲皮素相比，BZF在制备过程中显示出改善的溶解度相关特性。在所测试条件下，BZF在ATDC5细胞中引起的代谢活性降低少于槲皮素。BZF对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的损伤提供了更强的保护作用，并
槲皮素的一种氧化代谢产物BZF通过一种食品相容的方法合成。与槲皮素相比，BZF在制备过程中显示出改善的溶解度相关特性。在所测试条件下，BZF在ATDC5细胞中引起的代谢活性降低少于槲皮素。BZF对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的损伤提供了更强的保护作用，并更有效地降低了一氧化氮（NO）、活性氧（ROS）、白细胞介素-6（IL-6）、环氧合酶-2（COX-2）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）。无标记定量蛋白质组学揭示了BZF相关的抗氧化和炎症相关调控反应。
研究背景与现存问题
槲皮素是一种广泛存在于水果、蔬菜和谷物中的膳食类黄酮，具有广泛的生物活性，包括抗氧化和抗炎作用。然而，槲皮素的临床应用面临两大障碍：其一，其水溶性差、口服生物利用度低，导致体内循环浓度极低，与其体外观察到的强效生物活性之间存在长期矛盾；其二，槲皮素表现出环境依赖性的氧化还原行为，在高浓度或细胞应激条件下可能发挥促氧化毒性，例如降低细胞内谷胱甘肽水平、诱导线粒体DNA拷贝数减少及细胞凋亡。因此，探索槲皮素的氧化转化产物是否能够克服这些局限性具有重要意义。前期计算研究鉴定出一种槲皮素的氧化代谢物——2-(3,4-二羟基苯甲酰基)-2,4,6-三羟基-3(2H)-苯并呋喃酮（BZF），该化合物可能保留自由基清除活性并参与更广泛的抗氧化调控网络。然而，BZF在除吲哚美辛诱导损伤模型外的其他病理背景下的效应尚不清楚，其水溶性和药代动力学特性也未充分表征，且BZF与槲皮素发挥生物学效应的分子机制是否相似或不同仍有待阐明。此外，BZF在天然食物来源中含量稀少，仅在外层干洋葱中被检测到，因此需要开发可行的食品相容性转化策略来生产BZF。
研究内容与结论
研究人员首先采用一种实用且食品相容的方法将槲皮素转化为BZF，并系统评估了二者在水溶性及ATDC5软骨细胞中的效应。结果表明，BZF的水溶性比槲皮素提高约88至139倍。在细胞活力方面，槲皮素在100微摩尔浓度下处理24小时或在50微摩尔以上处理48小时后显著降低细胞活力，而BZF在所有测试浓度下均维持高细胞活力。在肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的炎症模型中，BZF在预处理、共处理和后处理三种方案下均表现出比槲皮素更强的细胞保护作用，且在高浓度下未显示细胞毒性。进一步检测发现，BZF比槲皮素更有效地抑制TNF-α诱导的一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）产生，并更显著地下调白细胞介素-6（IL-6）、环氧合酶-2（COX-2）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的mRNA表达。无标记定量蛋白质组学分析揭示，高剂量槲皮素诱导了广泛的蛋白质组改变，涉及蛋白质翻译机制、细胞骨架和细胞外基质组织以及代谢和能量相关途径，而BZF仅引起有限且选择性的蛋白质组变化。在TNF-α刺激条件下，BZF和槲皮素均部分逆转了TNF-α诱导的蛋白质组扰动，但BZF表现出更强的双向调节作用，尤其在线粒体功能、核因子κB（NF-κB）信号和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K-AKT-mTOR）通路方面具有更显著的调控优势。
关键技术方法
本研究采用了以下主要技术方法：通过MolSoft mProp平台进行理化性质预测；采用柠檬酸铁作为温和氧化剂，在乙醇-水体系中实现槲皮素向BZF的食品相容性转化；利用硅胶色谱结合超高效液相色谱（UPLC）进行分离纯化；通过超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）和核磁共振波谱（NMR）进行结构鉴定；采用改良摇瓶法测定水溶性；运用MTT法评估细胞代谢活性；使用Griess试剂测定一氧化氮（NO）释放；采用二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针检测活性氧（ROS）水平；通过定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测基因表达；应用基于数据非依赖性采集（DIA）模式的纳流液相色谱-串联质谱（nanoLC-MS/MS）进行无标记定量蛋白质组学分析，并使用DIA-NN软件进行数据处理，通过STRING数据库和R语言进行生物信息学分析。
研究结果
3.1 BZF的制备与结构鉴定
通过理化性质预测发现，BZF比槲皮素多一个氧原子，具有更高的预测极性，提示其水溶性可能改善。实验测量证实，BZF在水和磷酸盐缓冲液（PBS）中于25℃和37℃条件下的水溶性约为槲皮素的88至139倍。经UPLC-MS/MS和NMR确证，纯化后的BZF纯度约为90%。
3.2 BZF与槲皮素细胞保护活性的比较分析
MTT实验表明，槲皮素在100微摩尔（24小时）或50微摩尔以上（48小时）显著降低ATDC5细胞活力，而BZF在所有测试浓度下维持高细胞活力。在TNF-α诱导的炎症条件下，低浓度BZF和槲皮素均表现出细胞保护作用，但BZF的保护效果更强，且在高浓度下不加剧损伤。后续检测显示，BZF比槲皮素更有效地抑制NO和ROS产生，并更显著地下调IL-6、COX-2和iNOS的表达。
3.3 比较蛋白质组学分析
3.3.1 BZF和槲皮素对细胞活力的直接效应相关的蛋白质组变化
定量蛋白质组学分析鉴定出1625个蛋白组。主成分分析显示，仅高剂量槲皮素组发生显著变化。高剂量槲皮素诱导234个差异表达蛋白，富集于蛋白质翻译机制抑制、细胞骨架和细胞外基质组织破坏以及代谢重编程（增强糖酵解、减少线粒体脂肪酸氧化）。相比之下，BZF仅引起轻微蛋白质组变化，主要涉及细胞骨架组织的正向调节。
3.3.2 对抗TNF-α诱导扰动的蛋白质组基础
在TNF-α刺激后，鉴定出2464个蛋白组。TNF-α诱导1266个差异表达蛋白。BZF和槲皮素分别逆转其中192个和220个差异表达蛋白，其中105个重叠蛋白呈现一致的恢复趋势。亚细胞定位分析显示，BZF特异性蛋白更强烈地富集于线粒体功能组分。基因集富集分析表明，BZF和槲皮素均减弱上皮-间充质转化和氧化磷酸化，但BZF的抑制作用更强。BZF还可能与TNF-α/NF-κB和PI3K-AKT-mTOR信号通路的改变相关。
讨论与结论
讨论部分指出，槲皮素的高剂量毒性涉及三大功能改变：蛋白质翻译抑制、线粒体代谢紊乱和细胞骨架破坏，这些与槲皮素的促氧化活性一致。BZF在较低浓度下即表现出优于槲皮素的保护效果，但其有效浓度范围在不同细胞模型中尚未系统定义。蛋白质组学揭示BZF与槲皮素共享多个共同分子靶点和信号通路，但BZF的增强保护作用优先与线粒体功能、NF-κB信号和PI3K-AKT-mTOR通路的更强调控相关。研究还指出，BZF在自然界中稀有，仅存在于干洋葱外层，而本研究所建立的柠檬酸铁转化策略提供了一种获取BZF的可行途径。
结论翻译
总之，本研究提供了实验证据表明，与槲皮素相比，BZF具有显著改善的水溶性、在高浓度下更高的细胞耐受性，以及对TNF-α诱导损伤的增强保护作用。蛋白质组学分析进一步揭示了涉及氧化应激、炎症和细胞代谢的部分不同的分子响应。这些发现突显了BZF作为槲皮素生物活性替代物的潜力。更广泛地说，这种方法表明，通过食品相容的氧化转化形成BZF可能有助于克服母体化合物的某些局限性，同时保留或增强其生物活性，为通过受控食品加工调节膳食类黄酮的功能特性提供了一种有前景的策略。未来研究应探讨BZF的药代动力学、体内功效和潜在分子机制，以及其在真实食品加工系统中的生产可行性和稳定性。
