来自布氏海膜藻的紧凑型硫酸半乳聚糖组分通过NF-κB/MAPK信号通路诱导细胞凋亡并激活巨噬细胞

《Food Hydrocolloids for Health》：A compact sulfated galactan fraction from Hypnea boergesenii triggers apoptosis and activates macrophages through NF-κB/MAPK signaling

　　

摘要专业翻译： 本研究探讨了从红藻布氏海膜藻（Hypnea boergesenii）中提取的硫酸半乳聚糖（sulfated galactans）的结构与活性关系。通过热水提取及DEAE–Sepharose色谱（DEAE–Sepharose chromatography）分级，获得F1（HBF1）和F2（HBF2）两个组分。结构分析表明，二者均为富含半乳糖（galactose）和硫酸基团的类卡拉胶硫酸半乳聚糖。HBF2具有最高分子量（956.2×103 g/mol）和最低回转比容（specific volume of gyration, SVg，0.31 cm3/g），提示其具有高度紧凑且有序的分子构象。HBF2表现出最强的抗氧化活性及对MCF-7乳腺癌细胞的抗增殖作用，其半数抑制浓度（IC50）为2.13 mg/mL，并可显著诱导细胞凋亡。在RAW264.7巨噬细胞中，HBF2通过激活NF-κB和MAPK信号通路（包括p38、ERK和JNK的磷酸化），显著刺激一氧化氮（nitric oxide, NO）产生，并上调诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的表达。本研究揭示了硫酸基密度、分子紧凑性与信号介导的多功能生物活性之间的创新性关联，将HBF2确定为一种有前景的海洋生物活性化合物。

论文解读文章

一、研究背景与问题提出

海洋生态系统蕴含着结构多样且具有独特理化与生物学特性的生物聚合物资源。其中，海藻来源的多糖因其丰富性、可再生性、生物相容性及广泛的生物活性而受到持续关注。特别是红藻门（Rhodophyta）来源的硫酸化多糖，已被视为具有抗氧化、免疫调节、抗病毒及抗癌潜力的功能性生物材料。卡拉胶（carrageenan）是一类由3-连接的β-D-半乳吡喃糖（G单元）与4-连接的α-D-半乳吡喃糖残基（D单元）交替构成的线性硫酸半乳聚糖，其硫酸化程度及部分残基上的3,6-脱水桥结构存在差异。这些结构差异不仅决定其流变学行为，还通过调节电荷密度和分子构象深刻影响生物活性。

癌症仍是全球主要死亡原因之一，2024年全球估计新增约2060万例癌症病例，相关死亡约980万例。尽管治疗手段不断进步，传统疗法的局限性促使研究人员探索基于天然活性化合物的补充策略。硫酸化多糖被认为可通过直接抑制癌细胞增殖和诱导凋亡发挥抗癌作用，同时通过调节氧化应激、炎症及肿瘤免疫微环境间接发挥作用。已有研究表明，较低分子量、高度硫酸化的卡拉胶通常表现出更强的抗癌活性，这与其改善的细胞可及性及与分子靶点的更强相互作用有关。此外，硫酸化多糖还能增强巨噬细胞介导的免疫应答，其免疫刺激效力受硫酸基密度、电荷分布及分子量的强烈影响。

尽管对硫酸半乳聚糖已有大量研究，但天然提取并经色谱分级的多糖精细结构特征与其多功能生物活性之间的关系仍未被充分阐明。研究人员假设，色谱分级将产生具有不同结构特征（特别是分子量、硫酸含量和分子构象）的硫酸半乳聚糖组分，这些结构差异将差异化调控其抗氧化、抗癌和免疫刺激活性。基于此，本研究旨在从布氏海膜藻中提取硫酸化多糖（初步鉴定为卡拉胶），利用DEAE–Sepharose Fast Flow色谱进行分级，系统表征各组分，并通过体外实验及RAW264.7巨噬细胞模型评估其抗氧化、抗癌和免疫刺激活性，以阐明潜在的结构-活性关系。

二、研究内容与主要结论

研究人员从阿曼海北部海岸恰巴哈尔沿海区域采集布氏海膜藻标本，经热水提取获得粗多糖HBC，再经DEAE–Sepharose Fast Flow色谱分级获得HBF1和HBF2两个主要组分。结构表征显示，HBF2具有最高分子量（956.2×103 g/mol）和最低回转比容（0.31 cm3/g），表明其具有高度紧凑和有序的分子构象。活性评价表明，HBF2表现出最强的DPPH自由基清除能力，对MCF-7乳腺癌细胞具有最强的抗增殖作用（IC₅₀ = 2.13 mg/mL）并能显著诱导凋亡。在RAW264.7巨噬细胞中，HBF2通过激活NF-κB和MAPK信号通路（p38、ERK和JNK磷酸化），显著促进一氧化氮产生及iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。该研究揭示了硫酸基密度、分子紧凑性与信号介导的多功能生物活性之间的创新关联，将HBF2确定为有前景的海洋生物活性化合物。

三、主要关键技术方法

研究人员采用热水提取法从脱脂藻粉中提取粗多糖，利用DEAE–Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱以逐步NaCl梯度进行分级纯化。结构表征方面，采用钡氯-明胶浊度法测定硫酸基含量，酸水解衍生化结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析单糖组成，高效尺寸排阻色谱联用多角度激光光散射及示差折光检测（HPSEC-MALLS-RI）测定分子量及回转半径。活性评价方面，采用DPPH自由基清除实验评估抗氧化活性，MTT法检测抗增殖作用，流式细胞术分析细胞凋亡，Griess法测定一氧化氮产生量，Western blot检测信号通路蛋白磷酸化水平及炎症因子表达。

四、研究结果

4.1 多糖提取与分级

研究人员以80%乙醇预处理去除色素、脂质及低分子量次级代谢物，随后用蒸馏水于80°C提取2小时，乙醇沉淀获得粗多糖HBC。将HBC溶解后经DEAE–Sepharose Fast Flow柱分级，以蒸馏水及0.5至2.0 M NaCl梯度洗脱，经苯酚-硫酸法检测碳水化合物，合并阳性组分、透析（MWCO 3.5 kDa）并冻干，获得HBF1和HBF2两个主要组分。分级过程重复至少三次，回收率超过70%的批次方用于后续分析，各批次洗脱曲线相似，表明方法重现性良好。

4.2 结构表征

硫酸基含量测定采用钡氯-明胶浊度法。单糖组成经三氟乙酸水解、硼氘化钠还原及乙酰化衍生后，通过GC-MS分析。分子量参数采用HPSEC-MALLS-RI系统测定，回转比容按公式SV_g = 2.522R_g3/M_w计算。结果显示，两个组分均为富含半乳糖和硫酸基的类卡拉胶硫酸半乳聚糖。HBF2具有最高分子量（956.2×103 g/mol）和最低回转比容（0.31 cm3/g），表明其分子构象高度紧凑有序。

4.3 抗氧化活性

采用DPPH自由基清除实验评价抗氧化活性，以抗坏血酸为阳性对照。结果显示HBF2在所有测试浓度下均表现出最强的DPPH自由基清除能力，且呈浓度依赖性，表明其抗氧化活性与其结构特征密切相关。

4.4 抗增殖与凋亡诱导活性

以MCF-7乳腺癌细胞为模型评价抗增殖作用。结果显示HBF2显著降低细胞活力，IC₅₀为2.13 mg/mL，并能诱导显著凋亡。HBF2的抗癌活性与其高硫酸基密度和紧凑分子构象相关，这些特征可能增强了其与细胞靶点的相互作用。

4.5 巨噬细胞免疫刺激活性

在RAW264.7巨噬细胞中，HBF2显著刺激一氧化氮产生，并增强iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。机制研究表明，HBF2通过激活NF-κB和MAPK信号通路发挥作用，包括p38、ERK和JNK的磷酸化。这表明HBF2具有通过多条信号通路协同激活巨噬细胞的免疫调节潜力。

五、讨论与结论

讨论部分指出，硫酸化多糖的生物活性与其精细化学结构密切相关，包括单糖组成、糖苷键连接方式、分子量分布及硫酸化程度和位置。本研究中HBF2的高分子量和紧凑构象并未削弱其生物活性，反而与其最强的抗氧化、抗癌和免疫刺激活性相关联，这与以往认为低分子量多糖活性更高的观点有所不同。研究人员认为，硫酸基密度和分子紧凑性可能是决定其多功能生物活性的关键结构决定因素。HBF2通过NF-κB和MAPK信号通路激活巨噬细胞，提示其可作为潜在的免疫调节剂。研究结论指出，HBF2是一种有前景的海洋生物活性化合物，其结构-活性关系为设计新型功能多糖材料提供了理论依据，并为海洋来源天然产物的抗癌和免疫治疗应用提供了新思路。