CK2与PPM1D调控的TCOF1动态磷酸化控制核仁凝聚与RNA聚合酶I活性

《Nucleic Acids Research》：Dynamic phosphorylation of TCOF1 controlled by CK2 and PPM1D regulates nucleolar condensation and RNA polymerase I activity

　　

核仁是一种无膜细胞器，对于核糖体DNA（rDNA）转录和核糖体生物发生至关重要，然而调控其动态组装的机制仍不完全清楚。研究人员在此确定了镁依赖性蛋白磷酸酶1 delta（PPM1D）通过去磷酸化支架蛋白TCOF1而成为核仁结构的关键调控因子。通过结合超分辨显微镜和结构域定位，研究人员发现PPM1D通过C末端的一个保守基序定位到核仁。磷酸化蛋白质组学分析和结构建模揭示，PPM1D靶向TCOF1低复杂度重复结构域内由酪蛋白激酶2（CK2）磷酸化的位点，这影响其与RNA聚合酶I（Pol I）的相互作用、在纤维中心（FC）的固定以及核仁凝聚。PPM1D缺失或CK2抑制导致的磷酸化平衡破坏会引发核仁结构紊乱和rDNA转录减少。最后，研究人员证明，药理学抑制PPM1D可在p53依赖和非依赖背景下使细胞对RNA Pol I抑制剂敏感。总之，研究人员揭示了一个可逆磷酸化开关，它控制TCOF1的动态行为及其核仁功能，并对靶向癌症中的核糖体生物发生具有潜在意义。

核仁是无膜细胞器，主要负责核糖体DNA（rDNA）转录和核糖体生物发生。rDNA由RNA聚合酶I（Pol I）转录为前体RNA，随后加工为成熟rRNA。这一过程需要多种因子协同，其中TCOF1（Treacle）是一种核仁磷酸蛋白，其中心重复结构域（RD）含有丝氨酸/谷氨酸丰富的低复杂度区域（LCRs），可通过液-液相分离（LLPS）驱动核仁纤维中心（FC）的形成。虽然已知酪蛋白激酶2（CK2）可磷酸化TCOF1，但CK2介导的组成性磷酸化对TCOF1核糖体生物发生功能的影响尚未系统研究。磷酸酶PPM1D（镁依赖性蛋白磷酸酶1 delta）是DNA损伤反应的负调控因子和p53抑制剂，但其生理底物和基础细胞功能大多未知。因此，研究人员探讨了PPM1D是否通过调控TCOF1磷酸化影响核仁结构和rDNA转录。

研究人员通过邻近标记、磷酸化蛋白质组学、超分辨显微镜、结构建模和生化实验，揭示了CK2与PPM1D通过可逆磷酸化开关控制TCOF1的动态行为和核仁功能。研究发现PPM1D通过C末端核仁定位信号（NoLS）定位到核仁，去磷酸化TCOF1 LCRs中的CK2位点，从而调控TCOF1凝聚、与Pol I相互作用以及rDNA转录。该发现扩展了对磷酸酶塑造核仁区室化的理解，并为癌症中靶向核糖体生物发生提供了新策略。相关论文发表在《Nucleic Acids Research》。

研究采用的主要技术包括：基于BioID2的邻近生物素化标记联合质谱鉴定PPM1D相互作用蛋白；TiO2富集磷酸肽的定量磷酸化蛋白质组学；超分辨显微镜（3D-STED、3D-SIM）结合共聚焦和高内涵显微镜定位蛋白；荧光恢复后光漂白（FRAP）分析TCOF1流动性；体外激酶/磷酸酶实验验证直接去磷酸化；邻位连接分析（PLA）检测蛋白互作；AlphaFold结构预测；染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）检测rDNA上蛋白占据；透射电镜观察核仁超微结构；5-乙炔基尿苷（5EU）标记新生RNA；细胞增殖实验。细胞系包括人RPE1、U2OS、MCF7和HEK293来源的多种亲本及PPM1D敲除（KO）细胞。

**PPM1D通过C末端核仁定位信号靶向核仁**
通过邻近依赖的生物素化筛选，研究人员鉴定出PPM1D与多种核仁蛋白相互作用。共聚焦和超分辨显微镜显示，PPM1D少量定位于核仁FC，并与Pol I和UBF共定位。NoD软件预测和缺失突变体验证表明，PPM1D C末端581–589位点的保守碱性残基构成NoLS。PLA证实内源性PPM1D与fibrillarin和UBF在核仁中邻近，说明PPM1D通过该信号进入核仁。

**PPM1D对核仁DNA损伤反应的启动非必需**
利用RPE-iCut系统在28S rDNA或5S rDNA中诱导双链断裂，发现PPM1D抑制不影响核仁帽形成、RAD51招募或细胞存活，表明PPM1D不参与核仁DNA损伤反应的起始。

**PPM1D在低复杂度重复序列处去磷酸化TCOF1**
磷酸化蛋白质组学显示，PPM1D缺失或抑制导致739个本底磷酸化位点上调，这些位点富集于含谷氨酸/天冬氨酸/丝氨酸的区域，并涉及核糖核蛋白生物发生。TCOF1的多个LCR磷酸化位点受PPM1D调控。体外实验证实，重组CK2可磷酸化野生型TCOF1，而加入PPM1D催化结构域后磷酸化信号显著降低；将LCR中所有靶向丝氨酸突变为丙氨酸的TCOF1-SA突变体无法被磷酸化。免疫共沉淀和PLA显示，PPM1D与TCOF1相互作用，且依赖核仁定位。

**磷酸化促进TCOF1凝聚并调节其在纤维中心的流动性**
高内涵显微镜显示，TCOF1-SA和ΔRD突变体在核仁的富集程度低于野生型，且不能排除GC标志物NPM1，提示其自组装能力受损。ΔGtransfer分析表明，野生型TCOF1符合单组分相分离特征，而突变体在胞内高表达时出现相分离饱和。FRAP实验显示，TCOF1-SA和ΔRD的不可移动分数显著低于野生型；CK2抑制或PPM1D过表达也降低TCOF1的不可移动分数，而PPM1D缺失则相反。这说明磷酸化促进TCOF1在FC中的固定。

**TCOF1可逆磷酸化促进其与RNA聚合酶I的相互作用**
PLA和免疫共沉淀显示，TCOF1-SA与Pol I催化亚基POLR1A的相互作用弱于野生型，且不受CK2抑制影响；AlphaFold预测磷酸化RD与POLR1A正电荷DNA结合裂隙结合。在PPM1D-KO细胞中，TCOF1与POLR1A的邻近信号增强，但5EU标记的新生RNA减少，表明rDNA转录受损。ChIP-qPCR显示，TCOF1-SA在rDNA转录起始位点的占据减少，Pol I在rDNA全长的占据也降低；PPM1D-KO细胞中TCOF1和Pol I在转录起始位点的占据增加，但基因体处无显著差异。透射电镜显示PPM1D-KO细胞核仁FC与DFC混杂，结构紊乱。PPM1D-KO细胞核仁增大，可被野生型PPM1D拯救，而磷酸酶死亡突变体D314A不能；该增大不依赖p53。表达TCOF1-SA或ΔRD则减小核仁体积。

**抑制PPM1D使细胞对RNA聚合酶I抑制剂敏感**
DepMap数据库分析显示，PPM1D依赖性细胞对CX-5461和放线菌素D（ActD）的敏感性相关。药理学抑制PPM1D显著增强了RPE和MCF7细胞对CX-5461和ActD的敏感性，并伴随p53磷酸化及Caspase 7剪切增加。在TP53敲除细胞中，PPM1D抑制仍能增强对Pol I抑制剂的敏感性，表明存在p53非依赖机制。回补PPM1D可缓解PPM1D-KO细胞的药物高敏感性。

讨论部分指出，PPM1D通过NoLS直接靶向核仁底物，而非仅通过影响CDK1间接起作用。PPM1D和CK2对TCOF1的调控类似于RRN3在Pol I转录循环中的可逆磷酸化机制。PPM1D缺失导致的核仁增大可能源于TCOF1自组装增强，而非rRNA加工中间体积累，因为未观察到rRNA加工缺陷。TCOF1与PPM1D NoLS在四足动物中的共同出现提示协同进化。PPM1D可能通过选择性靶向LCRs成为液-液相分离的广泛调控因子。PPM1D抑制增敏Pol I抑制剂主要通过p53通路，也有p53非依赖成分。

总之，数据支持一个模型：PPM1D和CK2通过其RD结构域的动态磷酸化调控TCOF1的凝聚和功能。这种调控控制TCOF1与Pol I的关联及其在rDNA转录中的作用。这一发现扩展了对磷酸酶如何塑造核仁区室化的理解，并提示PPM1D可能通过选择性靶向LCRs充当液-液相分离的更广泛调控因子。