抗CD20介导的B细胞清除对多发性硬化症T细胞免疫的独特影响：效应记忆CD4 Th17与Th1.17亚群减少

《Immunobiology》：Anti-CD20 mediated B cell depletion exerts a distinct influence on T cell immunity by decreasing effector memory CD4 Th17 and Th1.17 subsets in multiple sclerosis

　　

摘要专业翻译 在未经治疗的多发性硬化症（MS）患者中，利妥昔单抗（RTX）的启动与较低的Th17和Th1.17细胞水平相关。基线T细胞亚群与年龄、B细胞数量及HLA-DRB1 * 15:01等位基因相关。CD8亚群、血浆炎症蛋白组及CD4 TCR克隆性基本保持不变。Th1.17细胞亦与疾病活动度相关，支持其在MS炎症中的作用。这些亚群可通过标准化的临床流式细胞术检测方案进行测量。

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研究背景与问题

多发性硬化症（MS）是一种好发于青壮年的慢性免疫介导性神经系统疾病，是导致中青年人群神经功能障碍的主要原因之一。MS的遗传风险主要集中于主要组织相容性复合体（MHC）区域，其中HLA-DRB1 * 15:01等位基因的存在与HLA-A*02:01的缺失对MS风险影响最为显著，其机制可能涉及T细胞受体（TCR）与抗原呈递细胞（APC）之间的相互作用。MS的病理过程涉及APC与T细胞之间的复杂互作，同时自然杀伤（NK）细胞和髓系来源细胞也参与其中。

2008年，一项以抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗（RTX）治疗复发缓解型MS（RRMS）的概念验证II期研究显示了其对炎症性疾病活动的强效抑制。后续多项临床试验证实了此类药物（包括ocrelizumab、ofatumumab和ublituximab）的高度有效性，为B细胞在RRMS炎症活动中发挥不可或缺的作用提供了有力证据。然而，抗CD20介导的B细胞清除与感染风险增加相关，主要增加细菌感染风险并降低疫苗接种的体液应答，但T细胞免疫仅受到轻微影响。

尽管已知B细胞在MS发病中发挥重要作用，但抗CD20降低MS疾病活动的具体机制尚不清楚。已有证据表明B细胞与T细胞之间通过MHC-TCR轴、共受体和可溶性介质存在复杂互作。此外，一小部分T细胞表面也表达CD20抗原（CD20^dim T细胞），可能被抗CD20单克隆抗体直接靶向清除。因此，本研究的主要目的是在真实世界临床队列中，系统表征抗CD20治疗前后T细胞亚群的变化，以更好地理解该类药物与RRMS中T细胞免疫的关联，为减轻治疗不良反应提供信息。

研究设计与方法

研究人员开展了一项基于瑞典卡罗林斯卡大学医院和斯德哥尔摩神经病学中心临床常规数据的回顾性观察研究。初始队列包含446名MS患者（pwMS），其样本于2017年1月1日至2020年3月1日期间使用美国国立卫生研究院流式免疫分型技术会议（FITMAN）方案进行了T细胞亚群流式细胞术分析。研究构建了三个主要数据集：1）128名未经治疗pwMS的基线T细胞亚群与年龄、B细胞、NK细胞、中性粒细胞和单核细胞数量的相关性分析；2）264名pwMS基线时复发与缓解状态间T细胞亚群的差异比较；3）126名pwMS在RTX治疗前后配对样本中T细胞亚群的变化。此外，还利用19名pwMS的配对血浆样本进行了Olink炎症蛋白组学分析，利用6名pwMS的CD4 T细胞DNA进行了TCRVβ测序。

主要技术方法包括：流式细胞术采用FITMAN方案，使用Navios流式细胞仪（Beckman Coulter）对全血样本进行检测，数据通过标准化门控策略处理；同时采用基于flowSpecs包中peakNorm函数的荧光强度批次间归一化处理和DepecheR包的无监督聚类分析，将CD4和CD8 T细胞分别聚类为T1至T6六个亚群，并进一步分为HLA-DR阳性和阴性组分。HLA-DRB1 * 15:01和HLA-A*02:01基因分型采用TaqMan SNP基因分型检测。统计分析使用R软件4.2.3版本，采用Wilcoxon符号秩检验（配对样本）、Spearman相关分析和Wilcoxon秩和检验（非配对样本），并通过错误发现率（FDR）校正控制多重检验。

研究结果

参与者特征、方法学考量及皮质类固醇的影响

共纳入310名pwMS，其中未经治疗组人数最多（160人，占52%），其余为从不同疾病修饰疗法（DMT）转换者。所有组别中女性占绝大多数（85%-97%），中位扩展残疾状态量表（EDSS）评分为2，复发缓解型MS（RRMS）比例约为80%。研究人员评估了流式细胞术染色方案变更可能引入的系统性偏差，通过69份相同样本的两种方法对比，发现仅CD4效应Th1.17细胞数量存在统计差异但幅度极小，判定方案变更带来的偏差风险非常轻微。皮质类固醇暴露组（采样前30天内接受脉冲式高剂量激素治疗）仅表现出较高的CD4效应Th1.17细胞和B细胞数量，该类样本从后续所有分析中排除。

协变量对基线T细胞亚群的影响

年龄与CD4记忆Th2、HLA-DR⁺及CD8记忆CXCR3^?CCR6^? T细胞呈正相关，与CD8初始T细胞呈负相关。携带HLA-DRB1 * 15:01等位基因的pwMS表现出总体CD8 T细胞数量减少，以及CXCR3⁺ CD8效应和记忆T细胞的特定减少，而HLA-A*02:01状态未见明显影响。B细胞数量与所有检测的CD4和大多数CD8 T细胞亚群呈正相关（除CCR6⁺或HLA-DR⁺ CD8记忆和效应细胞外）。NK细胞与多个CD4和CD8 T细胞亚群呈较弱正相关。单核细胞与多个CD4 T细胞亚群正相关，而中性粒细胞与T细胞亚群无相关性。

在疾病活动度分析中，未经治疗和干扰素-β治疗的pwMS在缓解期与活动期之间未检测到T细胞亚群差异。然而，富马酸二甲酯（DMF）治疗的pwMS在疾病活动期表现出CD4中央记忆（CM）和记忆Th1.17细胞以及记忆CD8⁺CXCR3⁺CCR6⁺ T细胞的增加。DMF组缓解期平均淋巴细胞数为0.98×10⁹/L，活动期为1.31×10⁹/L（p=0.044）。

抗CD20治疗对随访T细胞谱的影响

在未经治疗的pwMS（主要分析人群）中，RTX启动六个月后，三个CD4亚群——效应记忆（EM）、效应Th17和效应Th1.17细胞——显著减少，而CD8亚群未见显著变化。从那他珠单抗（NTZ）转换的患者表现出几乎所有CD4亚群（除CD4 EMRA外）和多个CD8亚群的减少，而从芬戈莫德（FGL）转换的患者则表现出多个CD4和CD8亚群的增加。这些不同模式最可能由停药后淋巴细胞再分布和免疫重建解释，而非抗CD20治疗本身的作用。

B细胞清除对血清蛋白组学的影响

在19名pwMS的亚组中，Olink炎症平台检测的92个生物标志物中有63个在所有样本中可测量。仅肿瘤坏死因子受体超家族成员9（TNFRSF-9，又称CD137和4-1BB）在抗CD20暴露后显著下降。未经过FDR校正时，IL10也达到名义显著性（p=0.046）。

B细胞清除对CD4 T细胞熵和克隆性的影响

对6名pwMS在RTX治疗前后配对的CD4 T细胞进行TCRVβ测序，未发现熵和克隆性的显著差异。

讨论与结论

本研究发现，在未经治疗的pwMS中，B细胞清除治疗的启动与效应Th17和Th1.17 CD4 T细胞亚群的减少相关。年龄与CD4记忆Th2表型增加正相关，这与MS患者随年龄增长复发活动降低的观察一致。HLA-DRB1 * 15:01携带者中多个CD8 T细胞亚群减少，可能反映该等位基因携带者更有效的抗体应答降低了对强效细胞毒性CD8应答的需求。B细胞数量与CD4和CD8 T细胞亚群的正相关可能由稳态机制和共享细胞因子（如IL2、IL7、IL15、IL21）或抗原呈递等共同因素解释。DMF治疗pwMS中疾病活动与Th1.17等亚群增加的关联，与既往研究中DMF主要影响CD4 CM T细胞和记忆Th1.17细胞以及IL17产生性CD8 T细胞抑制与较低疾病活动相关的发现一致。

B细胞清除后CD4效应记忆、效应Th17和Th1.17亚群的减少，提示B细胞清除可能优先影响这些亚群。Th1.17细胞（同时表达CXCR3⁺和CCR6⁺并产生IFN-γ）已被描述为MS脑脊液和病灶中的主要亚群。一种可能的解释是B细胞清除减少了向CD4 T细胞的抗原呈递，从而贡献于效应记忆Th17和Th1.17亚群的减少。然而，由于FITMAN方案无法分辨CD20⁺ T细胞，研究无法区分B细胞清除的间接效应与CD20⁺ T细胞直接清除的贡献。血浆蛋白组学中TNFRSF-9的降低可能与T细胞活化减少一致，但该探索性发现需在更大队列中验证。TCRVβ测序未检测到CD4 TCR库多样性和克隆结构的改变，但样本量小（n=6），不足以排除此类变化。

本研究的主要优势在于大规模真实世界临床队列，以及手动和自动门控分析之间的一致性，表明这些T细胞亚群可在标准化临床环境中可靠监测。研究结论为：尽管B细胞清除后总体T细胞免疫基本保留，但在未经治疗的pwMS中，特定的CXCR3+/?CCR6+亚群减少。这些亚群与MS疾病活动相关，研究观察与它们在B细胞清除应答中的作用一致，但尚不能证明因果关系。重要的是，这些亚群可在标准化临床环境中进行监测。