《Infection, Genetics and Evolution》：Site-specific distribution of
pfhrp2 and
pfhrp3 PCR non-amplification profiles in southern C?te d’Ivoire
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恶性疟原虫（*Plasmodium falciparum*）疟疾在撒哈拉以南非洲仍是主要的公共卫生负担，及时且准确的诊断对有效的病例管理和监测至关重要。尽管光学显微镜检查仍是重要的诊断方法，但在实验室能力有限的地区，快速诊断试验（rapid diagnos
恶性疟原虫（*Plasmodium falciparum*）疟疾在撒哈拉以南非洲仍是主要的公共卫生负担，及时且准确的诊断对有效的病例管理和监测至关重要。尽管光学显微镜检查仍是重要的诊断方法，但在实验室能力有限的地区，快速诊断试验（rapid diagnostic tests, RDTs）被广泛使用。最常用的RDT检测恶性疟原虫富组氨酸蛋白2（histidine-rich protein 2, PfHRP2），这是一种丰度较高且相对稳定的寄生虫抗原，可实现对红内期感染的敏感检测。携带* pfhrp2 *基因（位于8号染色体）缺失的恶性疟原虫对基于HRP2的RDT的有效性构成威胁。* pfhrp2 *缺失可能导致HRP2-RDT假阴性结果，尤其当其同源基因* pfhrp3 *（位于13号染色体）亦缺失且交叉反应的HRP3表位不存在时。此类感染可能未被检出，从而延误治疗并影响常规疟疾监测与控制活动。* pfhrp2 *与* pfhrp3 *缺失的流行率在疟疾流行区之间差异显著。埃塞俄比亚和厄立特里亚部分地区报告了较高频率，这些地区携带缺失的寄生虫降低了基于HRP2的RDT的诊断性能。相比之下，包括坦桑尼亚、安哥拉和刚果民主共和国在内的其他若干非洲国家报告了较低频率。国家内部亦观察到相当大的变异，提示缺失流行率可能受当地寄生虫种群结构、传播条件、医疗可及性、人口流动及诊断实践的影响。然而，横断面研究无法直接确定造成这些模式的选择性或进化机制。此外，常规基于PCR的缺失监测可能受模板浓度低、PCR抑制、引物结合位点多态性及不同检测方法分析灵敏度差异的影响；因此非扩增谱需要确证性检测。科特迪瓦存在常年疟疾传播，城市、城郊与农村地区之间在生态学和流行病学上存在显著差异。这些环境的蚊虫孳生条件、传播强度、医疗可及性以及显微镜检查与RDT的相对可及性各不相同。尽管基于HRP2的RDT广泛使用，科特迪瓦* pfhrp2 *与* pfhrp3 *缺失的信息仍有限。最近在布瓦凯开展的一项研究报告所检查个体中无* pfhrp2 *缺失，但该国其他地区的可比数据稀缺。特别是，对于生态学和流行病学特征迥异的地区之间缺失频率是否存在差异，所知甚少。本研究评估了科特迪瓦南部三个位点经显微镜确诊为恶性疟原虫感染的有症状患者中* pfhrp2 *与* pfhrp3 *的PCR扩增谱。研究人员考察了位点水平的变异以及与寄生虫密度、年龄和感染多重度的探索性关联。研究结果为指导确证性分子调查和扩大对可能影响基于HRP2疟疾诊断的推定缺失的监测提供了初步证据。
## 论文主体解读
**研究背景与问题**
恶性疟原虫（*Plasmodium falciparum*）疟疾在撒哈拉以南非洲仍构成重大公共卫生负担，及时准确的诊断是病例管理和监测的关键环节。在实验室能力有限的地区，基于恶性疟原虫富组氨酸蛋白2（histidine-rich protein 2, PfHRP2）的快速诊断试验（rapid diagnostic tests, RDTs）被广泛使用，因其能敏感检出红内期感染。然而，位于8号染色体的* pfhrp2 *基因缺失可使HRP2-RDT出现假阴性，尤其当位于13号染色体的同源基因* pfhrp3 *同时缺失、交叉反应性HRP3表位缺失时更为突出。此类漏检可延误治疗并削弱监测控制。缺失频率在非洲各地差异很大，埃塞俄比亚、厄立特里亚部分地区报告高频率，而坦桑尼亚、安哥拉、刚果民主共和国等报告较低频率，且国家内部亦存在显著变异。然而横断面研究无法直接判定选择性或进化机制；同时常规PCR监测受低模板浓度、PCR抑制、引物结合位点多态性及分析灵敏度差异影响，非扩增谱需确证。科特迪瓦为常年传播区，城市、城郊与农村生态流行病学差异明显，但该国* pfhrp2 */* pfhrp3 *缺失资料有限，布瓦凯一项研究未发现* pfhrp2 *缺失，其他地区数据稀缺，且不同 locality 间频率是否不同尚不清楚。为此研究人员开展了本研究，以初步评估科特迪瓦南部三个位点有症状、显微镜确诊患者的* pfhrp2 */* pfhrp3 * PCR扩增谱及其位点差异。
**主要技术方法**
研究为横断面分子流行病学研究，于科特迪瓦南部三家卫生机构（阿比让城市区Port-Bou?t、阿比让北部城郊Anonkoua-Kouté、东南部半农村Ayamé）纳入全年龄段、腋温≥37.5 °C或48 h内报告发热且镜检确诊恶性疟原虫单一感染的患者，排除重症疟疾、妊娠、慢性合并症者，共140例。方法包括：现场HRP2-RDT（SD-Bioline?）但不用于入组；静脉血涂片吉姆萨染色镜检计数无性体密度；滤纸干血斑Chelex-100法提取DNA；巢式PCR对*msp1* block 2与*msp2* block 3分型以评估DNA可扩增性及感染多重度（multiplicity of infection, MOI）；常规PCR检测* pfhrp2 *与* pfhrp3 *的外显子1–外显子2连接区及外显子2两个区域，以3D7株DNA为阳性对照、无核酸水为无模板对照，非扩增结果独立重复确认；以R 4.3.2进行Fisher精确检验、Monte Carlo模拟、Mann-Whitney U检验与Kruskal-Wallis检验。
**研究结果**
**研究人群基线特征。** 140例感染者中Anonkoua-Kouté 50例、Port-Bou?t 45例、Ayamé 45例；女性83例（59%），各点50%–67%（p=0.200）；年龄分布各点不同（p=0.029），平均21岁（2–67岁），<5岁儿童在Ayamé占20%、Port-Bou?t 13%、Anonkoua-Kouté 2%；寄生虫密度总体中位数20,487个/μL（IQR 5275–83,692），各点间无显著差异（p=0.400）。
***pfhrp2*与*pfhrp3*扩增谱的位点分布。** *pfhrp2*扩增谱在三点的分布差异显著（p<0.001）：双靶标均扩增（+/+）在Anonkoua-Kouté占74%、Ayamé 4.4%、Port-Bou?t 13%；完全非扩增（?/?）分别为6.0%、60%、40%；部分非扩增在Port-Bou?t尤为常见。*pfhrp3*谱在各点间无显著差异（p=0.452），总体103/140（74%）呈?/+谱（外显子1–外显子2连接区非扩增而保留外显子2扩增），仅23例（16%）双靶标均扩增，提示需用独立引物或测序法确认。按外显子2扩增状态合并分析，71例（51%）双基因外显子2均扩增，55例（39%）仅* pfhrp2 *外显子2非扩增，6例（4.3%）仅* pfhrp3 *外显子2非扩增，8例（5.7%）双基因外显子2同时非扩增；合并分布各点不同（p<0.001），主要由Ayamé与Port-Bou?t的* pfhrp2 *外显子2非扩增频率高于Anonkoua-Kouté所致。位点变异发生于采样时寄生虫密度分布大致相似的人群中，但横断面设计不能确定差异成因。
**双基因外显子2同时非扩增的流行病学与寄生虫学相关因素。** 8/140（5.7%）呈双外显子2非扩增，Anonkoua-Kouté 2.0%、Ayamé 8.9%、Port-Bou?t 6.7%，位点分布无统计学意义（p=0.355）。年龄组无显著关联（p=0.358），8例中4例≥30岁，16名<5岁儿童均无此谱。寄生虫密度类别与双外显子2非扩增相关（p=0.003）：8例中6例（75%）密度<5000个/μL，无人处于5000–<50,000个/μL，2例（25%）≥50,000个/μL；其余132例中低、中、高密度分别占21%、39%、39%。该探索性关联可能反映生物学差异、低模板浓度下PCR失败增加或二者兼有。
**扩增谱与感染多重度的关联。** 140例中单克隆42例、多克隆98例；*pfhrp2*（p=0.080）、*pfhrp3*（p>0.999）及合并外显子2状态（p=0.826）的扩增谱分布均未随感染复杂度显著不同。*pfhrp2*双靶标均扩增在单克隆与多克隆中分别占21%与37%，完全非扩增分别占36%与34%；*pfhrp3*的?/+谱在两者中分别占74%与73%；双外显子2非扩增分别见于3例（7.1%）与5例（5.1%）。结果不支持扩增谱与MOI存在明确关系，但不能排除中等强度关联。
**讨论与结论**
讨论指出，*pfhrp2*谱的显著位点变异扩展了科特迪瓦有限证据：布瓦凯报告无*pfhrp2*缺失，而本研究提示其他地区推定缺失谱频率差异很大；因每个流行病学环境仅由一个卫生机构代表，差异应解释为位点特异而非城市化、农村性或传播生态的一般效应，寄生虫种群结构、人口流动、就医行为、采样时间、诊断实践等未测因素均可能参与。HRP2-RDT使用被视为有利于*pfhrp2*缺失寄生虫的选择压力，模型提示其扩张取决于RDT使用时长与强度、传播强度、求医行为及缺失寄生虫相对适合度，但本研究缺乏RDT采购、品牌、检测覆盖等纵向信息，横断面数据不能判定诊断选择是否造成该分布。*pfhrp3* ?/+谱高频率需谨慎：其各点相近既可能反映广泛生物学模式，也可能为检测特异性非扩增；*pfhrp3*位于结构动态的亚端粒区，缺失可源于染色体重排、片段重复与端粒愈合，但常规PCR不能确立这些机制。双基因外显子2非扩增在低密度感染中更常见，工程化双基因缺失虫株红细胞内存活下降提供生物学上可能的适合度劣势基础，但仅基于8例，且低密度样本DNA少、更易在常规PCR失败，而巢式*msp1*/*msp2*灵敏度更高，故需定量单拷贝对照与独立确认方能作生物学解释。<5岁儿童中未见双外显子2非扩增，因年龄无显著关联且亚组样本小，仅属描述性观察。MOI与扩增谱无显著差异，但*msp1*/*msp2*估计的MOI不能判断谱型相似寄生虫的亲缘关系，需高分辨率基因组分析（同源一致与单倍型分析）。局限性包括：横断面机构内、有症状镜检阳性患者，不能代表无症状感染或社区种群；每个环境仅一个机构；样本量有限、无双基因确认、未经独立引物、定量PCR、断点分析或测序确认；缺乏历史RDT品牌与诊断实践信息；多重探索性比较未作多重性校正。结论：本探索性调查在科特迪瓦南部有症状恶性疟原虫患者中发现推定*pfhrp2*缺失谱存在显著位点水平变异；双基因外显子2同时非扩增不常见且不成比例地见于低密度感染，但不能排除寄生虫DNA浓度对PCR性能的影响；与MOI无明确关联。研究结果支持开展与WHO建议一致的扩大监测，纳入配对RDT与镜检结果、定量单拷贝对照靶标、疑似缺失的独立确认及高分辨率寄生虫基因组分析；现有数据提供重要基线，但不能独立确立诊断选择、生物学适合度代价或遗传相关缺失谱系的扩张。
