基于多组学解析假丝酵母强化发酵改善雪茄烟叶品质的代谢重塑机制

《Industrial Crops and Products》：Multi-omics reveals metabolic shifts by Candida-enhanced fermentation in improving cigar tobacco quality

　　

摘要专业翻译 多组学揭示假丝酵母强化发酵改善雪茄烟叶品质的代谢重塑机制 假丝酵母（Candida）接种可增加风味化合物并降低尼古丁和烟草特异性亚硝胺（TSNAs）含量。假丝酵母定殖重塑微生物群落结构而不改变α多样性。三羧酸（TCA）循环、尼古丁降解、硝酸盐异化还原和萜类合成模块显著富集。假丝酵母和克萨克氏菌（Kosakonia）对碳氮代谢和风味相关通路的贡献显著增加。尼古丁降解基因主要由谷氨酸杆菌（Glutamicibacter）携带。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

雪茄作为传统烟草制品，其独特风味的形成依赖于晾制、发酵和陈化等多个环节。近年来，中国手工雪茄市场需求快速增长，但国产雪茄在香气丰富度、刺激性和燃烧性等方面仍与古巴等国家的高端雪茄存在差距，优质原料短缺已成为产业发展的关键瓶颈。晾制后的雪茄烟叶存在柔韧性差、青杂气明显和刺激性高等缺陷，必须经过适当发酵才能改善品质。自然发酵周期长达1至2年，且质量不稳定，易出现霉变和腐败风险。人工发酵虽可将周期缩短至4至8周，但如何定向提升品质仍是研究难点。在人工发酵方法中，接种功能性菌株进行生物强化因其经济高效和可持续性而备受关注。已有研究表明，多种菌株如芽孢杆菌（Bacillus safensis）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）可不同程度提升烟叶风味成分或降低有害成分，但特定菌株如何重塑烟叶原位微生物群落的功能格局以改善品质，其机制尚不清楚。研究人员前期从雪茄烟叶中分离获得假丝酵母（Candida metapsilosis）SC-1菌株，并证实其具有降低刺激性和杂气的作用。然而，假丝酵母强化发酵如何改变微生物群落的功能潜力，以及哪些具体代谢通路负责观察到的品质改善，仍是未解之谜。因此，本研究采用宏基因组学和代谢组学整合分析，系统探究假丝酵母强化发酵对雪茄烟叶微生物群落结构、功能基因谱和代谢物组成的影响，旨在阐明该菌株改善烟叶品质的机制，为开发稳定、高质量的雪茄烟叶定向发酵工艺提供理论基础。

二、研究内容与主要结论

本研究以德雪一号填充烟叶为材料，接种假丝酵母SC-1菌株（接种浓度1×10? CFU/g），在35°C和75%相对湿度条件下发酵30天，以无菌水处理为对照，每组设置三个独立生物学重复。研究发现，假丝酵母强化发酵显著改变了烟叶的化学组成和感官品质：总糖和还原糖含量分别增加11.5%和23.2%，总氮和总生物碱分别降低2.1%和11.7%，尼古丁含量降低16.4%，烟草特异性亚硝胺总量降低18.4%，钾氯比显著升高。代谢组学共鉴定1653种化合物，其中248种为风味化合物，总风味成分含量增加13.7%，其中萜类、有机酸、氨基酸及衍生物、杂环化合物等关键风味成分均显著积累。感官评价显示，强化发酵改善了烟叶的甜度、香气丰富度、余味、醇和度、洁净度、燃烧性、灰分颜色和灰分凝聚力等指标。宏基因组分析表明，假丝酵母接种未改变微生物群落的α多样性，但显著重塑了物种组成和功能组成。假丝酵母在发酵过程中成功定殖并持续存在，发酵终点相对丰度为2.4%。强化组富集了克萨克氏菌、芽孢杆菌、葡萄球菌等风味相关菌属，以及假丝酵母、斯帕塔孢酵母等同科酵母菌属；对照组则富集了曲霉、青霉、镰刀菌等具有潜在腐败或植物致病性的菌属。功能富集分析显示，强化组显著富集了TCA循环、糖酵解、糖异生、尼古丁降解、硝酸盐异化还原和C10-C20异戊二烯生物合成等代谢模块，同时抑制了芳香族化合物降解和黄曲霉毒素生物合成等潜在有害代谢活动。酶基因功能贡献分析表明，假丝酵母和克萨克氏菌对肽酶和糖苷酶基因的贡献显著增加，促进了蛋白质和碳水化合物的降解以及糖苷结合态挥发性物质的释放。代谢通路分析进一步揭示，尼古丁降解模块主要由谷氨酸杆菌携带（相对贡献91.9%至98.6%），而硝酸盐异化还原、TCA循环和异戊二烯生物合成则涉及多菌属协同作用，其中克萨克氏菌的贡献在强化组中显著增加，假丝酵母也作为新贡献者出现。

三、关键技术与方法

本研究采用以下主要技术方法：宏基因组测序（metagenomic sequencing）用于解析微生物群落物种组成和功能基因谱；非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）基于UHPLC-Orbitrap Exploris 240质谱平台鉴定风味化合物、尼古丁和TSNAs；真菌ITS绝对定量测序（AccuITS?）用于监测发酵过程中真菌群落的动态变化；偏最小二乘判别分析（PLS-DA）用于代谢物谱区分；线性判别分析效应大小（LEfSe）用于识别组间差异微生物标志物；Reporter Score算法结合一般稳健亚通路分析（GRSA）用于KEGG模块功能富集分析。实验材料为德雪一号填充烟叶，由中国烟草四川工业有限责任公司提供。

四、研究结果

3.1 化学指标比较

通过连续流动分析仪和UHPLC-MS代谢组学测定，强化组总糖和还原糖显著增加，总氮和总生物碱降低，尼古丁和TSNAs含量下降，钾氯比升高，总风味成分含量增加13.7%。基于VIP>1鉴定出24种差异代谢物，包括L-苹果酸、L-焦谷氨酸、琥珀酸、4,5-二甲基噁唑、大马士酮、二氢猕猴桃内酯等。

3.2 物种和功能多样性

宏基因组测序显示，两组间Shannon、Chao1和Pielou-e等α多样性指数无显著差异，但基于Bray-Curtis距离的主坐标分析显示物种组成和功能组成均存在显著分离，表明假丝酵母强化发酵未改变多样性但重塑了群落结构。

3.3 物种和功能组成

假丝酵母属（Pseudomonas）是两组中最丰富的菌属，假丝酵母仅在强化组检出（2.4%相对丰度）。LEfSe分析显示强化组富集克萨克氏菌、芽孢杆菌、葡萄球菌等菌属，对照组富集曲霉、青霉、镰刀菌等菌属。真菌ITS绝对定量测序证实假丝酵母在发酵第0至10天快速增殖并持续至发酵终点。功能分析显示代谢是主导功能类别（平均45.7%），强化组显著富集42个KEGG模块，包括TCA循环、尼古丁降解、硝酸盐异化还原和C10-C20异戊二烯生物合成。

3.4 酶基因功能贡献分析

肽酶分析显示116个注释肽酶基因中25个显著上调，主要贡献菌属包括假丝酵母属、葡萄球菌属、泛菌属、假丝酵母和克萨克氏菌，其中假丝酵母和克萨克氏菌的贡献显著增加。糖苷酶分析显示86个注释糖苷酶基因中16个显著上调，主要贡献菌属包括克萨克氏菌、泛菌属、芽孢杆菌属等，假丝酵母和克萨克氏菌对多种糖苷酶的贡献在强化组中显著增加。

3.5 代谢通路分析和功能贡献分析

尼古丁降解模块（M00810）中全部8个KO显著上调，四种关键酶基因丰度显著升高，谷氨酸杆菌是主要贡献者（贡献率从91.9%增至98.6%）。硝酸盐异化还原模块（M00530）中3个KO显著上调，亚硝酸盐还原酶和醌类硝酸盐还原酶丰度显著升高，克萨克氏菌的贡献从10.2%显著增至24.1%。TCA循环模块（M00011和M00009）中12个KO显著上调，苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶丰度显著升高，假丝酵母属是主要贡献者，克萨克氏菌和假丝酵母的贡献显著增加。C10-C20异戊二烯生物合成模块（M00366）中全部3个KO上调，四种关键酶均上调，假丝酵母属贡献约50%，克萨克氏菌贡献从4.2%增至10.9%，假丝酵母从零增至1.8%。

五、讨论与结论

讨论部分指出，假丝酵母强化发酵通过定向重塑微生物群落结构实现品质提升，其机制包括：假丝酵母的定殖和增殖与群落重塑同步发生，富集风味相关菌属同时抑制潜在腐败和植物致病菌属；功能基因富集构成物质转化和品质形成的分子基础，TCA循环和糖酵解的富集促进了苹果酸、琥珀酸等有机酸的积累，这些有机酸可中和烟叶中的碱性成分从而降低刺激性和提升醇和度；C10-C20异戊二烯生物合成的富集为单萜、倍半萜和二萜类风味化合物的积累提供了前体骨架；尼古丁降解和硝酸盐异化还原的共同富集与尼古丁和TSNAs含量降低相一致，分别改善了感官品质和安全性。研究结论为：假丝酵母接种重塑了微生物群落而不改变α多样性，富集了风味相关菌属并抑制了潜在有害菌属；强化组显著富集TCA循环、C10-C20异戊二烯生物合成、尼古丁降解和硝酸盐异化还原等关键模块；这些功能转变伴随着有机酸、萜类、还原糖和糖苷风味前体的协调增加，以及尼古丁和TSNAs的降低，与品质改善一致。值得注意的是，尼古丁降解基因主要由谷氨酸杆菌携带（相对基因丰度91.9%至98.6%），而假丝酵母和克萨克氏菌对TCA循环、硝酸盐还原和萜类生物合成的贡献增加。这些发现为开发雪茄烟叶定向发酵工艺奠定了基础，对工业规模应用和产品一致性具有意义。但研究也指出，宏基因组数据反映的是遗传潜力而非实际代谢通量，观察到的关联不意味着因果关系，未来需要采用宏转录组学、蛋白质组学或同位素示踪等方法验证功能活性和调控机制。