《Industrial Crops and Products》：CsaHOS1 homeologs regulate seed development and fatty acid accumulation in
Camelina sativa under different temperature and photoperiod conditions
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植物通过感知温度、光周期和冷胁迫等环境信号，并将其与生长、开花、种子发育及代谢调控相整合，从而维持生存与繁殖成功。在调控这些环境响应过程中，蛋白质泛素化作为关键的翻译后调控机制发挥作用，E3泛素连接酶通过控制特定靶标蛋白的稳定性来精确调控信号传导与发育程序。H
植物通过感知温度、光周期和冷胁迫等环境信号，并将其与生长、开花、种子发育及代谢调控相整合，从而维持生存与繁殖成功。在调控这些环境响应过程中，蛋白质泛素化作为关键的翻译后调控机制发挥作用，E3泛素连接酶通过控制特定靶标蛋白的稳定性来精确调控信号传导与发育程序。HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLY RESPONSIVE GENES 1（HOS1）是植物中研究最为深入的RING型E3泛素连接酶之一，最初在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中被鉴定为冷响应的负调控因子。早期研究表明，hos1突变体在低温条件下表现出冷响应基因的过度激活，随后研究揭示HOS1通过泛素化并降解CBF表达诱导因子1（ICE1）蛋白来抑制C-repeat结合因子（CBF）依赖的冷信号传导。HOS1的作用不仅限于冷信号传导。后续研究表明HOS1在开花时间调控中发挥重要作用。在拟南芥中，hos1突变体表现出早花表型，HOS1与CONSTANS（CO）蛋白互作并调控其稳定性，从而控制FLOWERING LOCUS T（FT）表达和光周期依赖性开花。此外，在低温条件下，HOS1介导CO降解，并作为环境温度变化与开花调控之间的分子纽带。HOS1还通过FT和TWIN SISTER OF FT（TSF）途径在低环境温度下调控开花响应。综上，这些发现表明HOS1不仅是胁迫响应因子，也是连接环境信号与发育转变的调控枢纽。近年来，HOS1还与核孔复合体及核质运输的调控相关联。HOS1作为一种核孔相关E3连接酶，是mRNA输出所必需的，并已被报道通过与被称作核孔蛋白的NUP96和NUP160等互作来调控CO蛋白稳态和开花。此外，HOS1不仅参与蛋白质降解，还参与染色质水平调控，包括通过调节FLC位点上HDA6相关的染色质动态来激活FLC转录。综上，前人研究表明HOS1作为一个多功能调控因子，整合冷信号传导、光周期开花、温度响应、核孔复合体功能和染色质调控。尽管取得了上述进展，迄今大多数HOS1研究主要集中于其在拟南芥等模式植物中的开花调控、冷信号传导和胁迫响应中的作用，而其种子发育和脂质代谢方面的功能仍很大程度上未被探索。值得注意的是，目前即使在拟南芥中也没有直接证据将HOS1与种子发育或贮藏脂质积累的调控联系起来。种子油脂积累是一个高度协调的过程，涉及脂肪酸生物合成、去饱和、延伸、三酰甘油（TAG）组装和贮藏组织发育。重要的是，这些过程对环境条件高度敏感，包括温度和光周期，这些因素影响碳分配、种子成熟、脂肪酸组成和油脂生产力。关键调控因子如WRINKLED1（WRI1）通过激活糖酵解和脂肪酸生物合成途径促进种子油脂积累，而脂肪酸去饱和酶如FAD2和FAD3调控不饱和脂肪酸的产生，这些不饱和脂肪酸不仅有助于种子油品质，还参与温度适应和膜脂稳定性。鉴于HOS1作为环境信号依赖性基因表达和发育响应的重要调控因子发挥作用，HOS1可能通过整合环境信号影响种子脂质代谢。因此，理解这一潜在调控联系对于阐明植物环境适应和油脂生产力的机制具有重要意义。亚麻荠（Camelina sativa，Csa）是一种十字花科油料作物，因其生命周期短、农业投入需求低、种子含油量高以及适合遗传转化和基因组编辑，作为工业油生产和代谢工程的平台而受到广泛关注。随着气候变化持续加剧，温度等环境因素日益影响作物生产力和种子油脂性状。温度变化可影响种子发育、油脂积累和脂肪酸组成，从而影响油产量和品质。因此，理解连接环境响应与种子油脂代谢的分子机制对于开发气候韧性油料作物日益重要。亚麻荠在系统发育上与拟南芥近缘，并具有异源六倍体基因组，使其成为研究基因冗余和功能分化的理想作物系统。近期基因组研究为进一步理解亚麻荠的进化起源和亚基因组组织提供了新见解，包括相关二倍体物种的染色体水平组装和改进的参考基因组。比较基因组和群体研究为亚麻荠的遗传多样性、亚基因组组织和进化变异提供了见解，为这一多倍体作物的功能基因组研究提供了宝贵资源。然而，其多倍体性质使单基因模式系统的发现难以直接应用，需要在作物本身对重复同源基因进行功能表征。为研究HOS1在多倍体油料作物中的作用，研究人员利用系统发育、表达和基于CRISPR/Cas9的功能分析对亚麻荠中的HOS1同源基因进行了表征。研究人员还检测了野生型和csahos1突变体植物在不同温度和光周期条件下的种子脂肪酸积累。研究结果表明CsaHOS1同源基因在测试的环境条件下参与植物生长、种子发育和脂肪酸积累。高阶突变体表现出更严重的发育缺陷，包括三突变体在28 °C下无法产生成熟种子。这些结果为深入研究CsaHOS1介导的发育调控与环境响应之间的关系提供了基础。
研究背景方面，植物通过感知温度、光周期和冷胁迫等环境信号，将其与生长、开花、种子发育及代谢调控相整合，以维持生存与繁殖成功。蛋白质泛素化作为关键翻译后调控机制，E3泛素连接酶通过控制靶标蛋白稳定性精确调控信号传导与发育程序。HOS1（HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLY RESPONSIVE GENES 1）是研究最为深入的RING型E3泛素连接酶之一，最初在拟南芥中被鉴定为冷响应负调控因子，通过泛素化降解ICE1（inducer of CBF expression 1）抑制CBF（C-repeat binding factor）依赖的冷信号传导。后续研究表明HOS1还参与开花时间调控，与CO（CONSTANS）蛋白互作调控其稳定性，控制FT（FLOWERING LOCUS T）表达和光周期依赖性开花；在低温下介导CO降解，作为温度变化与开花调控的分子纽带。近年研究发现HOS1还与核孔复合体及核质运输相关，作为核孔相关E3连接酶参与mRNA输出，并通过与NUP96和NUP160等核孔蛋白互作调控CO蛋白稳态和开花；此外还参与染色质水平调控，通过调节FLC位点上HDA6相关染色质动态激活FLC转录。然而，目前大多数HOS1研究主要集中于模式植物拟南芥中的开花调控、冷信号传导和胁迫响应，其在种子发育和脂质代谢中的功能仍很大程度上未被探索，即使在拟南芥中也无直接证据将HOS1与种子发育或贮藏脂质积累联系起来。种子油脂积累涉及脂肪酸生物合成、去饱和、延伸、TAG（triacylglycerol，三酰甘油）组装和贮藏组织发育等高度协调过程，对环境条件高度敏感。亚麻荠（Camelina sativa）作为十字花科油料作物，具有生命周期短、投入低、含油量高、适合遗传转化和基因组编辑等优点，且为异源六倍体，是研究基因冗余和功能分化的理想系统。研究人员为探究HOS1在多倍体油料作物中的作用，对亚麻荠HOS1同源基因进行了系统发育、表达和基于CRISPR/Cas9的功能分析，并检测了不同温度和光周期条件下野生型和csahos1突变体的种子脂肪酸积累。研究结论表明，CsaHOS1同源基因在测试环境条件下参与植物生长、种子发育和脂肪酸积累，高阶突变体表现更严重的发育缺陷，三突变体在28 °C下无法产生成熟种子。该研究将HOS1的潜在功能拓展至非生物胁迫信号传导和开花调控之外，提示其在多倍体油料作物种子发育和脂肪酸积累中的作用，为深入研究CsaHOS1介导的发育调控与环境响应关系提供了基础。
关键技术方法方面（不超过250字）：研究人员以亚麻荠品种Suneson为材料，基于DH55参考基因组（NCBI RefSeq GCF_000633955.1）鉴定CsaHOS1同源基因，用MEGA 7.0以最大似然法构建包含26个物种HOS1直系同源蛋白的系统发育树（Selaginella moellendorffii为外群）。利用Cas-Designer设计两条靶向三个同源基因保守区的sgRNA，构建含egg cell特异性EC1.1启动子驱动Cas9及DsRed筛选标记的pHEE401E-mDsRED载体，经农杆菌介导 floral dip转化获得T1代，经T2–T4代筛选纯合无荧光突变体。采用RT-qPCR分析组织特异性表达（以CsaACTIN-2为内参）。成熟种子经脂肪酸甲酯化后用气相色谱（GC-FID）定量脂肪酸。植株在22 °C或28 °C及长日照/短日照条件下培养，分三个独立实验组比较。
研究结果方面：结构特征、表达模式与系统发育保守性分析——通过基因组分析鉴定到三个CsaHOS1同源基因（CsaHOS1-A、CsaHOS1-B、CsaHOS1-C），分别位于Chr4、Chr6和Chr5，编码序列均为2811 bp，编码936个氨基酸，分子量约106 kDa，均含N端保守锌指/RING型结构域和C端ELYS样结构域；RT-qPCR显示三基因在叶、花、茎和发育种子中均有表达，生殖组织中转录积累较高；最大似然法系统发育分析表明三个CsaHOS1蛋白与十字花科HOS1蛋白聚为一支，形成密切相关的亚组，提示其为基因组加倍产生的同源基因。利用CRISPR/Cas9构建csahos1单突变体及高阶突变体——设计两条sgRNA同时靶向三个同源基因，获得单突变体（csahos1-aa、csahos1-bb、csahos1-cc）、双突变体（csahos1-aacc、csahos1-bbcc）和三突变体（csahos1-aabbcc），突变主要为1–3 bp插入缺失，多数导致移码和提前终止密码子，三突变体在三个基因中均携带纯合突变。CsaHOS1突变对生长和开花性状的影响——49 DAG观察显示csahos1-aa单突变体开花较早、生长略增强，csahos1-cc生长略降低但开花时间无明显差异，csahos1-bbcc双突变体生长迟缓更明显，csahos1-aabbcc三突变体株型显著减小且开花延迟。种子发育缺陷与脂质积累改变——野生型种子呈均匀椭圆形，csahos1-cc呈皱缩表型，高阶突变体种子变小且严重皱缩；异常种子比例随突变复杂度递增，三突变体约80–90%异常；csahos1-bbcc和csahos1-aabbcc种子重量显著降低（最高达22%），总FAME含量（μg mg?1和μg seed?1）显著下降（脂肪酸最高降低34%）；脂肪酸组成分析显示突变体特别是高阶突变体中α-亚麻酸（18:3）含量降低，棕榈酸（16:0）和硬脂酸（18:0）等饱和脂肪酸比例升高，亚油酸（18:2）等不饱和脂肪酸也发生相对变化。温度和光周期对csahos1突变体种子发育和脂质积累的影响——实验分三个独立组：22 °C下长日照与短日照比较、长日照下22 °C与28 °C比较、短日照下22 °C与28 °C比较；22 °C下突变体种子皱缩更明显，28 °C下种子异常更严重且颜色变暗、严重皱缩，短日照28 °C下csahos1-aabbcc三突变体完全不产种子；28 °C下能产生成熟种子的基因型种子重量和总脂肪酸积累均降低；22 °C下三突变体油酸（18:1）、亚油酸（18:2）和α-亚麻酸（18:3）绝对含量低于野生型；28 °C下总脂肪酸大幅降低限制了组成变化的解释。
讨论部分总结：本研究将HOS1的潜在功能拓展至非生物胁迫信号和开花调控之外，提示其在多倍体油料作物种子发育和脂肪酸积累中的作用。CRISPR/Cas9突变分析显示三个同源基因存在功能冗余，单突变体表型较轻而双突变体和三突变体缺陷更明显；高阶突变体的皱缩种子和脂肪酸积累降低类似于WRI1等脂质生物合成调控因子缺陷突变体的表型，但突变体种子仍可存活，脂肪酸积累减少可能部分反映种子发育受损而非CsaHOS1对脂质代谢的直接作用，且FAME定量不能区分TAG与其他脂质类别。环境实验显示28 °C下种子重量和总脂肪酸积累降低，三突变体在两种光周期下28 °C均无法产生成熟种子，表明CsaHOS1功能缺失与测试环境条件下的种子发育和脂肪酸积累受损相关；但由于环境处理在独立实验组中进行，不能建立温度与光周期的直接互作，也未统计确立基因型×环境互作，不能证明CsaHOS1直接感知温度或整合温度与光周期信号。高温下总脂肪酸大幅降低使单个脂肪酸变化难以解释，SAD、FAD2、FAD3的活性和基因表达均未检测。鉴于CsaHOS1保守的RING型E3泛素连接酶结构域，其可能通过泛素介导调控种子发育或脂质代谢相关蛋白间接影响脂肪酸积累，WRI1、LEC2、FAD2、FAD3和DGAT等为可能的下游通路，但这些蛋白尚未被鉴定为CsaHOS1的直接底物。未来研究检测脂质相关基因表达及鉴定CsaHOS1互作蛋白和泛素化靶标将有助于阐明连接环境信号、种子发育和脂肪酸代谢的分子机制。研究结论翻译：这些发现提示CsaHOS1同源基因在测试的环境条件下参与植物生长、种子发育和脂肪酸积累，高阶突变体表现出更严重的发育缺陷，包括三突变体在28 °C下无法产生成熟种子；这些结果为深入研究CsaHOS1介导的发育调控与环境响应之间的关系提供了基础。
