《Industrial Crops and Products》：Integration of MAPK signaling, terpenoid biosynthesis, and lncRNA regulation in the response of
Pinus massoniana to pine wilt disease
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马尾松（Pinus massoniana）是中国南方广泛分布的本土针叶树种，因生长迅速、耐瘠薄及经济价值高而被广泛栽培。然而，该树种对松材线虫病（pine wilt disease，PWD）高度易感，该病由松材线虫（pine wood nematode，PWN
马尾松（Pinus massoniana）是中国南方广泛分布的本土针叶树种，因生长迅速、耐瘠薄及经济价值高而被广泛栽培。然而，该树种对松材线虫病（pine wilt disease，PWD）高度易感，该病由松材线虫（pine wood nematode，PWN；Bursaphelenchus xylophilus）引起，可迅速破坏寄主维管系统并在数月内导致植株死亡。萜类化合物是植物防御中的一类重要特化代谢物，其生物合成经胞质甲羟戊酸（mevalonate，MVA）途径与质体甲基赤藓醇磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途径介导。马尾松抗性种源中α-松油醇、长叶烯及sandaracopimaradiene等特定萜类含量显著高于感病种源，多个萜类合酶（terpene synthase，TPS）基因在PWN侵染后迅速诱导且其酶促产物可直接抑制线虫活性，但萜类生物合成在PWN侵染过程中的协同调控及其对PWD抗性的精确贡献尚不完全清楚。植物免疫包括病原相关分子模式触发的免疫（PAMP-triggered immunity，PTI）与效应子触发的免疫（effector-triggered immunity，ETI），丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号在将胞外信号转导为转录重编程与代谢响应中发挥核心作用；长非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）亦被报道在植物免疫中于转录及转录后水平调控基因表达，但马尾松中lncRNA介导的调控尤其在PWD抗性背景下的认识仍有限。已有研究描述了PWN侵染后马尾松的转录组或代谢组变化，但MAPK信号、萜类生物合成、抗性相关基因与lncRNA之间的时序协同仍不清楚。为此，研究人员结合Illumina RNA测序、基于PacBio Iso-Seq的转录本重建、时间分辨短时间序列表达分析（short time-series expression analysis，STEM）与加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA），并在多个抗性与感病家系中进行RT-qPCR验证，构建了从发现到验证的框架以优先筛选可能与PWD抗性相关的候选基因与lncRNA。结果表明，高抗马尾松家系表现出涉及MAPK信号相关基因、植物激素相关途径、抗性基因、lncRNA及萜类生物合成基因的时序协调转录重编程，而非依赖单一防御组分，这些响应在侵染进程中呈阶段特异性与多层组织方式。值得注意的是，参与萜类骨架形成及单萜、倍半萜和二萜生物合成的基因在接种后早期与晚期被强烈诱导。包括PmTPS4（APS2）、CAS、IDS与APS1在内的四个TPS基因在抗性家系中的表达显著高于感病家系，支持其作为抗性评价与种质筛选分子标记的潜在价值。尽管仅凭转录组证据无法确立因果抗性机制，该研究结果为后续功能验证与代谢组分析提供了宝贵资源，并可为马尾松PWD抗性分子育种策略提供参考。
马尾松（Pinus massoniana）是中国南方广泛栽培的重要用材与生态针叶树种，具有生长快、适应性强及经济价值高等特点，其木材、纤维及松脂均为重要工业原料，同时在次生演替与森林生态恢复中发挥关键作用。然而，该树种对由松材线虫（pine wood nematode，PWN；Bursaphelenchus xylophilus）引起的松材线虫病（pine wilt disease，PWD）高度易感，线虫迅速破坏寄主维管系统，导致受害植株在数月内死亡，自1982年在中国首次暴发以来已扩散至18个省份，造成严重经济损失与森林破坏。因此，解析马尾松对PWN的抗性分子响应并鉴定候选抗性相关基因，对可持续森林经营与抗性育种具有重要意义。萜类化合物是植物防御中的关键特化代谢物，经胞质甲羟戊酸（mevalonate，MVA）途径与质体甲基赤藓醇磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途径合成异戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）与二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）等通用前体，并进一步由单萜合酶（monoterpene synthase，MoTPS）、倍半萜合酶（sesquiterpene synthase，SeTPS）及二萜合酶（diterpene synthase，DiTPS）等催化生成多样化产物。已有研究表明抗性种源中α-松油醇、长叶烯等特定萜类含量较高，多个TPS基因在PWN侵染后迅速诱导且产物可抑制线虫活性，但萜类生物合成在侵染过程中的协同调控及其对抗性的精确贡献尚不清楚。植物免疫包括病原相关分子模式触发的免疫（PAMP-triggered immunity，PTI）与效应子触发的免疫（effector-triggered immunity，ETI），丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）级联在信号转导中居核心地位，长非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）亦参与植物免疫调控，但马尾松中相关认识有限，且MAPK信号、萜类生物合成、抗性相关基因与lncRNA之间的时序协同尚未解析。针对上述问题，研究人员以高抗PWD家系GKT1的三年生幼苗为材料进行PWN接种，于接种前0 d及接种后4、7、14、21 d采集针叶，结合Illumina RNA测序与PacBio Iso-Seq全长转录本重建，开展差异表达分析、KEGG富集分析、STEM时间序列聚类与WGCNA共表达网络分析，鉴定候选hub基因、抗性基因、转录因子及lncRNA，并在10个高抗家系（GK1-GK10）与2个感病家系（YG1、YG2）中通过RT-qPCR验证候选基因，同时借助油松（Pinus tabuliformis）已发表的单细胞转录组数据对候选基因同源物的细胞表达模式进行比较分析。研究得出结论：高抗马尾松家系对PWN侵染表现出时序协调的转录重编程，涉及MAPK信号相关基因、植物激素相关途径、抗性基因、lncRNA与萜类生物合成基因，这些响应以阶段特异性和多层方式组织，而非依赖单一防御组分；萜类骨架及单萜、倍半萜、二萜生物合成基因在接种后早期与晚期被强烈诱导；PmTPS4（APS2）、CAS、IDS与APS1四个TPS基因在抗性家系中表达显著高于感病家系，支持其作为抗性评价与种质筛选分子标记的潜在价值。该研究虽不能仅凭转录组证据确立因果抗性机制，但为后续功能验证与代谢组分析提供了资源，并可为马尾松PWD抗性分子育种提供参考。研究方法上，主要关键技术包括：Illumina RNA-seq转录组测序与PacBio Iso-Seq全长转录本测序及基于CNCI、CPC2、PLEK三种工具的lncRNA编码潜力预测；STEM时间序列表达聚类与WGCNA共表达网络分析及基于Degree中心性的hub基因鉴定；RT-qPCR在多个抗性与感病家系中的表达验证（供试材料为江西林业科学院预先筛选的三年生GKT1家系及经三年重复接种筛选的GK1-GK10与YG1-YG2家系）。研究结果如下：转录组测序概览方面，15个测序文库共获得1747,407,670条clean reads（262.11 Gb），Q20与Q30分别达98.68%–99.02%与95.82%–96.86%，Iso-Seq经聚类去冗余后获得52,540条非冗余异构体，其中51,002条在至少一个数据库中获得功能注释，重复样本组内相关性高于组间，表明生物学重复可靠。lncRNA预测与表达谱方面，三种工具一致判定658条转录本为lncRNA，过滤低表达后保留118条，STEM分析鉴定出Profile 24、30、16、5与43共5个显著聚类表达谱，分别包含15、8、8、20与12条lncRNA，显示PWN接种后lncRNA呈时序差异化表达响应。差异表达基因鉴定与富集分析方面，4 d vs 0 d、7 d vs 0 d、14 d vs 0 d与21 d vs 0 d分别鉴定5742、4081、2688与5525个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），四个比较共有400个DEGs，KEGG富集显示各比较中MAPK信号通路均显著富集；整合该通路中FPKM ≥ 10的基因，鉴定出69个模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）基因、48个受体样胞质激酶（receptor-like cytoplasmic kinase，RLCK）基因、18个MAPKKK、14个MAPKK、5个MAPK及6个下游WRKY基因，且不同基因集在4 d或21 d优势表达，提示时序差异化的MAPK级联被激活；此外还鉴定出乙烯信号相关22个、脱落酸信号相关18个、油菜素内酯信号相关5个、氧化爆发相关5个及钙流相关6个基因，以及210个差异表达的转录因子基因，均呈时序差异表达。WGCNA方面，4432个基因被聚为20个共表达模块，black、blue、darkred、lightcyan与tan模块分别与0、4、7、14与21 d样本显著相关；blue模块含4条lncRNA、6个转录因子基因与9个R基因，darkred模块含1个转录因子与2个R基因，lightcyan模块含23条lncRNA与7个转录因子基因，tan模块含15条lncRNA、68个转录因子与24个R基因；基于Degree前10%标准，四个模块分别获得22、9、10与166个hub基因，RT-qPCR验证显示blue模块中Pm.t59143（转录因子）、Pm.t60016（lncRNA）与Pm.t1805（R基因）在4 d迅速诱导达峰后下降，lightcyan模块中lncRNA Pm.t55459、Pm.t48968与Pm.t32272在7–14 d延迟诱导达峰，tan模块中Pm.t51470（转录因子）、Pm.t38012（转录因子）与Pm.t52579（R基因）在21 d才急剧上升，表明不同模块候选hub基因可能参与不同时序阶段的响应。关键萜类生物合成基因鉴定与验证方面，仅tan模块基因显著富集于萜类骨架生物合成与二萜生物合成通路；共鉴定86个FPKM ≥ 10的萜类生物合成相关基因，其中62个差异表达，多数在接种后4 d或21 d高表达；选取20个DEGs进行RT-qPCR验证，除Pm.t64869（DXS）、Pm.t53129（SeTPS）与Pm.t46668（DiTPS）外，其余17个基因在4 d或21 d显著上调，Pm.t51044、Pm.t64029、Pm.t65825、Pm.t60449与Pm.t62370分别注释为异海松二烯合酶（isopimaradiene synthase，IDS）、长叶烯合酶（longifolene synthase，LOS）、石竹烯合酶（caryophyllene synthase，CAS）、(+)-α-蒎烯合酶1（APS1）与(?)-α-蒎烯合酶2（APS2）；在10个抗性与2个感病家系中的RT-qPCR分析显示，Pm.t64029（LOS，PmTPS21）在感病家系YG1中表达显著高于抗性家系，而Pm.t62370（APS2，PmTPS4）、Pm.t65825（CAS）、Pm.t51044（IDS）与Pm.t60449（APS1）在抗性家系中显著高于感病家系，为这些基因与抗性表型的关联提供了跨遗传背景的独立支持。候选萜类与抗性相关基因的比较细胞表达模式方面，借助油松单细胞转录组图谱，Pm.t51044、Pm.t60449、Pm.t62370、Pm.t64029、Pm.t65825与Pm.t38012的同源物在树脂道分泌细胞中呈明显优先表达，提示树脂道分泌细胞可能为所鉴定的萜类生物合成与抗性相关响应提供重要细胞背景，但该推断基于近缘物种，属比较性证据。讨论部分总结如下：研究人员认为，本研究揭示的广泛转录重编程涉及MAPK信号通路、萜类生物合成、R基因、转录因子与lncRNA，凸显了PWN诱导防御调控的复杂性；不同MAPKKK、MAPKK与MAPK的时序差异化表达提示不同MAPK组分可能在PWN侵染过程中依次激活并参与持续防御响应；乙烯、脱落酸、氧化爆发与钙信号相关基因的差异表达提示MAPK级联与激素相关防御途径间可能存在串扰，但转录组数据对马尾松中具体激素互作的证据有限，应视为需进一步实验验证的潜在关联；MAPK信号与特化代谢调控密切相关，本研究中萜类生物合成相关基因的诱导与近期多组学研究一致，α-蒎烯、长叶烯与异海松酸对PWN活性的抑制作用为萜类代谢参与松树防御提供了生物学支持，但基因表达升高不一定意味着萜烯积累或松脂产量增强，需代谢组与生化分析加以确定，所提出的MAPK与萜类介导防御间的联系应理解为可能的调控关联而非确证的因果机制；候选TPS与转录因子同源物在树脂道分泌细胞中的优先表达与树脂道上皮细胞专司油树脂生物合成的认识一致，支持树脂道相关细胞参与萜类相关防御响应的可能性，但需马尾松单细胞或空间转录组数据验证；除已报道的PmNBS-LRR97与PmHs1pro-1外，本研究鉴定出Pm.t52579与Pm.t1805两个新的候选抗性相关基因且呈时序差异化诱导，提示PWN抗性可能涉及更广泛的NBS-LRR相关基因群；Pm.t55459、Pm.t48968、Pm.t32272与Pm.t60016为可能与PWD抗性相关的PWN响应lncRNA，据其表达模式与共表达关系推测其可能作为内源靶标模拟物 sequester 特定miRNA，但功能与直接分子互作未经实验验证，马尾松缺乏高效稳定转化体系亦为验证带来挑战；由于本研究未设仅创伤对照，所观察变化应解释为机械创伤与PWN接种联合处理相关响应而非确证的PWN特异性响应，但标准化机械创伤为松树PWN转录组研究的常用接种程序，该局限影响单个响应的精确归因但不否定对接种处理相关转录变化的整体刻画；本研究在解析MAPK响应的时序多样化、将阶段相关共表达模块与特定候选lncRNA、转录因子及抗性相关基因相联系、以及鉴定表达模式与抗性遗传背景可重复关联的萜类生物合成基因三个方面拓展了既往研究；此外，时间进程实验仅用单一高抗家系、转录组与共表达分析主要提示统计学关联而非直接调控或因果关系、hub基因应视为候选而非确证的核心调控因子等局限亦应予以考虑，未来需开展候选lncRNA、R基因与hub基因的功能验证及调控机制分析，并结合适当创伤对照与代谢组、生化测定以明确所观察转录响应与PWN侵染及萜烯积累的关联程度。结论部分译文如下：本研究采用整合的Illumina RNA-seq与PacBio Iso-Seq分析刻画了马尾松对PWN侵染的动态转录响应，结果表明高抗马尾松家系表现出涉及MAPK信号相关基因、植物激素相关途径、抗性基因、lncRNA与萜类生物合成基因的时序协调转录重编程，这些响应并非依赖单一防御组分，而是在侵染进程中以阶段特异性和多层方式组织；值得注意的是，参与萜类骨架形成及单萜、倍半萜与二萜生物合成的基因在接种后早期与晚期被强烈诱导，包括PmTPS4（APS2）、CAS、IDS与APS1在内的四个TPS基因在抗性家系中的表达显著高于感病家系，支持其作为抗性评价与种质筛选分子标记的潜在价值；尽管仅凭转录组证据无法确立因果抗性机制，该研究结果为未来功能验证与代谢组分析提供了宝贵资源，并可为马尾松PWD抗性分子育种策略提供参考。
