《Industrial Crops and Products》：High-intensity natural sweeteners from four representative plants: Biosynthetic pathways, heterologous production, and molecular markers
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肥胖和糖尿病的日益增长负担构成了重大的全球公共卫生挑战。减少游离糖摄入是代谢风险控制的重要策略。在此背景下，来源于植物的非糖类甜味剂因其高甜度、低热量值及潜在的健康促进作用而备受关注。在积累甜味代谢物的植物中，甜叶菊（Stevia rebaudiana）、罗汉
肥胖和糖尿病的日益增长负担构成了重大的全球公共卫生挑战。减少游离糖摄入是代谢风险控制的重要策略。在此背景下，来源于植物的非糖类甜味剂因其高甜度、低热量值及潜在的健康促进作用而备受关注。在积累甜味代谢物的植物中，甜叶菊（Stevia rebaudiana）、罗汉果（Siraitia grosvenorii）、甘草（licorice）和青钱柳（Cyclocarya paliurus）是具有代表性的物种。这四种植物的主要甜味成分在结构上截然不同：甜菊糖苷（steviol glycosides）是ent-贝壳杉烷衍生的二萜糖苷（diterpene glycosides），而罗汉果苷（mogrosides）、甘草酸（glycyrrhizin）和青钱柳苷（cyclocariosides）则分别是衍生自葫芦烷（cucurbitane）、齐墩果烷（oleanane）和达玛烷（dammarane）骨架的三萜糖苷（triterpene glycosides）。尽管它们亲缘关系较远，但新近的生物化学证据表明，其各自的生物合成途径共享一种保守的模块化组织。该整体途径结构包含四个主要阶段：异戊二烯前体供应、萜类骨架形成、由细胞色素P450单加氧酶（P450s）催化的氧化修饰，以及由尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶（UGTs）催化的葡萄糖基化或葡萄糖醛酸基化。本综述系统评估了新兴基因组资源与功能研究如何推动对这四组植物中甜味糖苷生物合成的理解，并为异源生产和分子育种提供依据。共同的生物合成模块为比较途径特异性反应以及评估支持基因和酶功能的证据强度提供了基础。重点阐述了候选基因鉴定与功能验证之间的差距，并以青钱柳中尚未解决的花环苷生物合成末端步骤为例进行说明。这一综合分析确定了酶学表征、异源途径重建和基因组辅助种质改良的优先方向。
论文解读文章
1. 研究背景与现存问题
肥胖和糖尿病已成为全球性的重大公共卫生挑战。2022年，全球肥胖人口超过10亿；预计到2024年，约有5.89亿成年人患有糖尿病，至2050年这一数字可能攀升至8.53亿。减少游离糖摄入是控制代谢风险的关键策略之一，世界卫生组织建议将游离糖摄入量控制在总能量摄入的10%以下。因此，安全、低热量的蔗糖替代品引起了食品科学、营养学和植物生物技术领域的广泛兴趣。相较于一些人工甜味剂，植物来源的非糖类甜味剂因其高甜度、低热量以及潜在的健康益处而备受重视。
在众多积累甜味代谢物的植物中，甜叶菊（Stevia rebaudiana）、罗汉果（Siraitia grosvenorii）、甘草（licorice）和青钱柳（Cyclocarya paliurus）是代表性物种。它们的甜味成分结构多样，但其生物合成途径却共享一个保守的模块化组织，包括异戊二烯前体供应、萜类骨架形成、细胞色素P450单加氧酶（P450s）催化的氧化修饰以及尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶（UGTs）催化的糖基化。然而，尽管这些植物的基因组资源已可用，但下游途径的验证程度极不均衡。例如，甜菊糖苷的生物合成研究历史悠久且功能证据充分，而青钱柳中花环苷（cyclocariosides A和I）的特定下游氧化和糖基化步骤仍缺乏功能性验证。因此，系统地比较和评估这些途径的研究进展，识别知识空白，对于指导未来的酶学表征、异源途径重建和分子育种至关重要。
2. 研究目的与意义
本研究旨在系统性地评估新兴基因组资源和功能研究如何推动对上述四组植物中甜味糖苷生物合成的理解。通过比较共有的生物合成模块，为途径特异性反应的比较和基因功能证据强度的评估奠定基础。特别强调了候选基因鉴定与功能验证之间的差距，尤其是青钱柳中花环苷生物合成未解决的末端步骤。这一综合分析旨在确定酶学表征、异源途径重建和基因组辅助种质改良的优先研究方向，从而促进这些天然甜味剂的可持续生产和应用。
3. 关键技术方法
研究人员综合运用了多种前沿技术方法：首先，采用高通量测序技术（如Illumina、PacBio、Oxford Nanopore Technologies）结合Hi-C染色质构象捕获技术，对四种植物的基因组进行了测序和染色体水平的组装，部分物种实现了端粒到端粒（T2T）和无间隙的基因组组装。其次，利用转录组学（RNA-seq）和代谢组学分析，结合基因共表达网络，筛选参与甜味化合物生物合成的候选P450和UGT基因。此外，通过异源表达系统（如大肠杆菌Escherichia coli、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae和本氏烟草Nicotiana benthamiana）对候选基因进行功能验证，并结合体外酶活测定、蛋白质结构建模与分子对接、定点突变等生化手段阐明酶的功能与催化机制。最后，通过代谢工程和合成生物学策略，在微生物和植物宿主中重构完整的生物合成途径，实现目标化合物的异源生产。
4. 研究结果
2. 基因组测序与分析
研究人员对不同植物的基因组进行了测序和分析，揭示了重复序列含量、杂合度和倍性水平对组装质量的显著影响。对于甜叶菊，高重复序列曾是其组装的巨大挑战，但通过整合PacBio和Hi-C技术获得了染色体级别参考基因组。研究发现，CYP和UGT基因家族的串联复制和拷贝数扩张是甜菊糖苷生物合成谱系特化的关键驱动力。单倍型分辨率的组装进一步揭示了UGT位点的结构变异和等位基因偏向性表达，且甲基化模式与UGT表达水平相关。对于罗汉果，早期基因组调查发现其高杂合度是组装的主要障碍。比较基因组学分析表明，早期途径基因在果实发育过程中的协同转录上调，而非基因簇的形成，在罗汉果苷生物合成的进化中发挥了更关键的作用。随后获得的单倍型分辨的端粒到端粒参考基因组揭示了两个单倍型间的显著结构变异。对于甘草属植物，染色体级别的基因组比较发现了已知生物合成基因的同源物在三种药用物种间高度保守，而存在/缺失变异区域富集了次生代谢基因。研究发现，局部基因复制和调控分化，而非古老的全基因组复制，可能是甘草酸生物合成特化的主要贡献者。对于青钱柳，作为同源四倍体植物，其基因组组装面临解析同源染色体拷贝的挑战。通过解析四倍体基因组为四个单倍型并构建二倍体参考基因组，研究人员揭示了多倍化后的不等位基因保留现象，并与P450家族的分化相关联。虽然全基因组复制相关的剂量效应被认为与萜类代谢基因有关，但这些关联性数据并未建立基因剂量与三萜积累之间的因果关系。
3. 主要甜味化合物的生物合成
研究人员详细阐述了四种植物中甜味化合物的生物合成途径。所有途径都始于通用异戊二烯前体，但甜叶菊的二萜途径主要依赖质体中的2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（MEP）途径，而罗汉果、甘草和青钱柳的三萜途径则主要依赖胞质中的甲羟戊酸（MVA）途径。在骨架形成后，P450介导的区域选择性氧化引入羟基和羰基。在甜叶菊中，ent-贝壳杉烯氧化酶（ent-KO）催化ent-贝壳杉烯的连续氧化，但负责C13羟基化的关键内源酶仍未确定。在罗汉果中，环氧化物水解酶（EPH）和CYP87D18共同作用形成罗汉果醇（mogrol）。在甘草中，CYP88D6和CYP72A154分别催化β-香树脂醇（β-amyrin）的连续氧化，最终形成甘草次酸（glycyrrhetinic acid）。在青钱柳中，虽然已鉴定出能将2,3-氧化鲨烯环化为达玛烯二醇-II（dammarenediol-II）的三萜环化酶CpalOSC8，但后续的氧化步骤尚无功能验证。随后的糖基化或葡萄糖醛酸基化决定了最终甜味糖苷的结构。在甜叶菊中，一系列UGT（UGT85C2、UGT91D2、UGT74G1、UGT76G1/G4）顺序地将甜菊醇转化为莱鲍迪苷A、D和M。在罗汉果中，UGT720-269-1和UGT94-289-3负责连续的葡萄糖基化，其中末端β-1,2葡萄糖基化是限速步骤。在甘草中，纤维素合酶来源的GuCSyGT和UGT73P12分别催化第一步和第二步葡萄糖醛酸基化，形成甘草酸。青钱柳中花环苷A和I的生物合成途径仍未被解析，仅有基于结构的假设路线。
4. 主要甜味化合物的异源生产
研究人员总结了在工程微生物和植物宿主以及无细胞酶系统中生产这些甜味化合物的进展。对于甜菊糖苷，已在酿酒酵母中实现了莱鲍迪苷A和M的高效生产，后者通过全细胞催化可达12.5 g/L，转化率77.9%。在无细胞体系中，通过工程化蔗糖合酶和UGT，莱鲍迪苷M的产量高达93.35 g/L。对于罗汉果苷，通过代谢工程在酵母中首次实现了罗汉果苷V的从头生物合成，产量在5升生物反应器中达到28.62 mg/L。同时，在大肠杆菌和无细胞体系中，通过酶工程和UDP-葡萄糖再生，实现了西美苷I和罗汉果苷VI的高效生产。对于甘草酸相关化合物，已在酵母中实现了从简单碳源到甘草次酸和甘草次酸-3-O-单葡萄糖醛酸苷（GAMG）的从头合成，并通过引入人源UGT1A1成功生产了甘草酸。由于青钱柳的下游途径尚不清楚，因此尚无针对花环苷A和I的异源生产系统报道。研究人员指出，由于途径范围和前体需求的内在差异，从头生物合成与前体喂养的生物转化所报告的滴度不能直接比较。
5. 总结与结论
本综述系统评估了四种代表性植物中高甜度天然甜味剂的生物合成研究进展。研究表明，尽管这些甜味化合物结构多样，但其生物合成途径共享一个保守的模块化框架。基因组资源的快速发展，特别是染色体水平和单倍型分辨率的组装，极大地促进了候选基因的挖掘。然而，从候选基因鉴定到功能验证之间存在显著差距，这在青钱柳中表现得尤为突出。通过比较分析，研究人员明确了在酶学表征、异源途径重建和基因组辅助育种方面的优先研究方向。未来的研究应聚焦于：对青钱柳中尚未鉴定的P450和UGT进行功能验证；优化微生物细胞工厂，提高复杂糖苷（如莱鲍迪苷M、罗汉果苷V和甘草酸）的产量和纯度；以及利用基因组信息和分子标记，通过分子育种手段改良种质资源，培育高含量、高品质的甜味植物品种。这些努力将为可持续地满足市场对天然、健康甜味剂的需求奠定坚实基础。
