基于响应面法优化常规溶剂提取技术从Inula viscosa中提取黄酮类化合物的工艺及其抗氧化与抗菌活性评价

《Industrial Crops and Products》：Response surface methodology for the optimization of conventional solvent extraction of flavonoids from Inula viscosa

　　

本研究采用Box-Behnken设计（BBD）结合响应面法（RSM），对从Inula viscosa中提取总黄酮（TFC）的常规溶剂提取（CSE）工艺进行优化，考察了提取温度、提取时间、乙醇浓度和固液比四个独立变量对TFC得率的影响。通过方差分析（ANOVA）评估模型的显著性和拟合度，并利用三维响应面图分析各变量间的交互作用。在最优条件下（提取温度63.482 ^°C、提取时间0.5 h、乙醇浓度80.195%、固液比90 mL/g）进行验证实验，TFC得率为285.233 ± 0.334 mg QE/100 g DM，与预测值293.922 mg QE/100 g DM接近。优化提取物表现出较强的抗氧化活性，DPPH自由基清除的IC₅₀值为16.805 ± 1303 μg/mL，ABTS自由基清除的IC₅₀值为9.904 ± 0.003 μg/mL，FRAP值为695.184 ± 22.40 Fe²⁺ μmol/g干提取物。采用LC-MS鉴定出咖啡酸、没食子酸和龙胆酸三种酚类化合物。抗菌实验表明，该提取物对多数革兰氏阴性菌株的抑制作用较弱，对部分革兰氏阳性菌株及真菌也表现出有限的抑制活性。研究结果表明，将常规提取技术与响应面优化策略相结合，可有效提高Inula viscosa黄酮类化合物的提取效率，所得提取物具有作为天然抗氧化剂的开发潜力。

研究背景方面，Inula viscosa（又名Dittrichia viscosa）为菊科植物，原产于地中海地区，在阿尔及利亚北部广泛分布，民间常用于治疗炎症、感染和皮肤疾病。该植物的生物活性归因于其丰富的化学成分，包括酚酸类、黄酮类、单宁、萜类等。黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等多种生物活性，在食品和医药领域应用广泛。目前研究人员多采用浸渍法从Inula viscosa中提取生物活性物质，但据研究人员所知，尚未有关于采用常规溶剂提取（CSE）法优化阿尔及利亚产Inula viscosa黄酮提取工艺的公开报道。单因素实验耗时、成本高且无法确定变量间的交互作用，而响应面法（RSM）作为一种有效的数学统计技术，可同时研究多个实验变量及其交互作用对响应值的影响，具有实验次数少、精度高、预测性能好等优势。因此，本研究旨在采用Box-Behnken设计（BBD）优化Inula viscosa黄酮的提取工艺，并对优化提取物的抗氧化和抗菌活性进行评价，同时通过LC-MS鉴定酚类化合物。

研究人员开展的研究及结论：研究人员通过单因素实验筛选了影响总黄酮含量（TFC）得率的关键因素及其实验范围，进而采用四因素三水平的BBD进行响应面优化，建立了二次多项式回归模型。模型的决定系数R²为0.9753，校正决定系数R²_adj为0.9523，模型极显著（p < 0.0001），失拟项不显著，表明模型拟合良好。最优提取条件下TFC得率达285.233 ± 0.334 mg QE/100 g DM，与预测值接近，验证了模型的可靠性。优化提取物表现出较强的抗氧化活性，LC-MS鉴定出咖啡酸、没食子酸和龙胆酸三种酚类化合物。抗菌实验显示提取物对多数革兰氏阴性菌抑制作用较弱，对部分革兰氏阳性菌和真菌也仅表现出有限活性。该研究的重要意义在于：首次对阿尔及利亚产Inula viscosa的CSE黄酮提取工艺进行了系统优化，证明了常规提取技术结合响应面优化策略可有效提高植物提取物的生物活性潜力，为将该提取物开发为天然抗氧化剂应用于食品、营养保健品或化妆品领域提供了科学依据。

关键技术方法概述：研究人员采用常规溶剂提取法（CSE）从Inula viscosa干燥粉末中提取总黄酮，以乙醇-水混合体系为溶剂，在双壁反应器中搅拌加热提取。采用Box-Behnken设计（BBD）进行四因素三水平的响应面优化实验，共30组实验（含6组中心点重复），使用JMP软件（Version 14.0, Pro）构建实验设计并分析数据。总黄酮含量（TFC）采用氯化铝比色法测定，以槲皮素为标准品。抗氧化活性通过DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和铁还原抗氧化能力（FRAP）法三种方法评价。酚类化合物采用高效液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行鉴定。抗菌活性采用琼脂孔扩散法评价，受试菌株包括14株细菌（来源于ATCC及实验室菌株）和3株真菌（来源于阿尔及利亚干燥无花果分离的赭曲霉毒素产生菌株及实验室菌株）。植物样品于2021年12月采自阿尔及利亚Médéa地区Tamezgida Dhaia（海拔1230 m），取地上部分阴干后粉碎过400 μm筛保存备用。

研究结果方面：（1）影响TFC得率的单因素实验：通过单因素实验确定各变量的适宜实验范围。提取温度在30–70 ^°C范围内TFC得率随温度升高而增加，70 ^°C时达峰值，超过70 ^°C后得率下降，可能归因于高温导致热敏性黄酮降解；提取时间从0.5 h延长至1 h得率增加，超过1 h后得率下降，表明长时间加热导致黄酮破坏；乙醇浓度从0%升至100%时TFC得率持续增加，100%乙醇时达最大值，提示该植物中多数黄酮为非极性；固液比从30 mL/g增至80 mL/g时提取效率提高，80–100 mL/g时反而下降，80 mL/g时得率最高。（2）CSE条件的响应面优化：通过BBD建立二次多项式回归模型，ANOVA分析表明对TFC得率影响最大的独立变量为提取温度（X1）和固液比（X4）（p < 0.0001），其次为乙醇浓度（X3）（p < 0.01），提取时间（X2）影响不显著（p > 0.05）。交互作用中X1X4和X2X4极显著（p < 0.01），X1X2显著（p < 0.05）。响应面分析显示，低温（60–65 ^°C）短时间（0.5–0.75 h）条件下TFC得率较高，高温（70–80 ^°C）长时间（1.25–1.50 h）导致得率下降；80%乙醇在低温短时条件下得率较高；高固液比（85–90 mL/g）配合高温或短时提取可提高得率。模型预测最优条件为提取温度63.482 ^°C、提取时间0.5 h、乙醇浓度80.195%、固液比90 mL/g，验证实验得率为285.233 ± 0.334 mg QE/100 g DM，与预测值293.922 mg QE/100 g DM接近，证明模型可靠。（3）总酚含量（TPC）：优化提取物的TPC为8097.545 ± 487.81 mg GAE/100 g DM，低于文献报道的突尼斯、摩洛哥和阿尔及利亚产Inula viscosa提取物，差异可能归因于提取方法、气候条件、地理来源和采收季节等因素。（4）DPPH自由基清除活性：提取物DPPH清除能力的IC₅₀值为16.805 ± 1303 μg/mL，与文献报道值接近，证实Inula viscosa具有较强的抗氧化特性。（5）ABTS测定：提取物ABTS自由基清除的IC₅₀值为9.904 ± 0.003 μg/mL，低于文献报道的Inula viscosa地上部和根部提取物的IC₅₀值。（6）FRAP测定：提取物的FRAP值为695.184 ± 22.40 Fe²⁺ μmol/g干提取物，低于文献报道的Inula britannica水醇提取物和其他菊科植物的FRAP值，表明该提取物的还原抗氧化能力相对较低。（7）LC-MS鉴定酚类化合物：通过与标准品保留时间比对，鉴定出咖啡酸、没食子酸和龙胆酸三种酚类化合物，其他标准品如甘菊素、柚皮素、 pedalitin、水杨酸、p-香豆酰己糖苷酸、绿原酸和4-羟基苯甲酸未被检出。由于缺乏MS²碎片数据，鉴定结果应视为推测性，需进一步LC-MS/MS分析确认。（8）抗菌活性测定：优化提取物对多数革兰氏阴性菌株抑制作用有限，仅对大肠杆菌、产酸克雷伯菌和肠道沙门氏菌等少数菌株有抑制效果；对革兰氏阳性菌株的抑制作用也较弱，但对枯草芽孢杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）有抑制作用；对真菌的抑制活性有限，对黑曲霉和黄曲霉有抑制作用，对赭曲霉无抑制作用。革兰氏阴性菌细胞膜含脂多糖，可降低抗生素通透性和渗透性，这可能是其耐药性较强的原因。提取物抗菌活性差异可能与提取方法和条件、采收时期和地点等因素有关。

讨论与结论部分总结：讨论部分指出，本研究证明了采用常规溶剂提取法结合响应面优化策略可显著优化Inula viscosa总黄酮的提取工艺。同时优化提取温度、提取时间、乙醇浓度和固液比四个参数，获得了较高的黄酮回收率（285.233 ± 0.334 mg QE/100 g DM），提取物表现出较强的抗氧化活性。该研究证明了将常规提取技术与适当软件的优化策略相结合以提高植物提取物生物活性潜力的价值。尽管抗菌活性较低，但抗氧化活性结果凸显了该优化提取物作为天然抗氧化剂的应用价值，特别是在食品、营养保健品或化妆品配方中，植物基替代品的需求持续增长。LC-MS分析鉴定出三种多酚化合物，虽然这一数量不能代表该植物的酚类多样性，但表明优化总黄酮得率是可行的，但不一定保证提取或检测到提取物中所有分子。未来研究应比较该优化方法与创新技术的效果，扩展提取物的代谢组学分析，研究提取物分级分离以分离和表征最具活性的化合物，并进行体内外研究和实际基质评估以确保提取物的稳定性、安全性和有效性。总之，本研究为地中海地区广泛使用的药用植物的价值化做出了重要贡献，为进一步优化其功能特性、改善其植物化学表征以及设计基于其生物活性化合物的创新应用奠定了坚实基础。研究结论翻译：本文证明，采用常规溶剂提取法可显著优化Inula viscosa总黄酮含量的得率。同时优化提取温度、提取时间、乙醇浓度和固液比，获得了较高的黄酮回收率（285.233 ± 0.334 mg QE/100 g DM），并表现出较强的抗氧化活性。本研究证明了将常规提取技术与优化策略相结合以提高植物提取物生物活性潜力的价值。尽管所得抗菌活性仍然较低，但观察到的抗氧化活性结果凸显了将该优化提取物主要用作天然抗氧化剂的相关性，特别是在食品、营养保健品或化妆品配方中，对植物基替代品的需求持续增长。相反，非常有限的抗菌活性表明可通过富集生物活性物质或与其他提取物协同作用来探索改进。LC-MS分析在优化提取物中鉴定出三种多酚。虽然这一数量不能代表该植物的酚类多样性，但这一发现强调优化总黄酮得率是可行的，但不一定保证完全提取或完全检测提取物中存在的分子。这些限制为增强对提取物实际植物化学特征的理解以及改进提取或分析方法提供了有希望的机遇。进一步研究应旨在将该优化提取方法与其他创新技术进行比较，扩展提取物的代谢组学分析，并研究提取物的分级分离以分离和表征最具活性的化合物。此外，体内和体外研究以及在实际基质中的评估将确保提取物在实践条件下评估的稳定性、安全性和有效性。最终，本研究为地中海地区广泛使用的药用植物的价值化做出了实质性贡献，并为进一步优化其功能特性、改善其植物化学表征以及设计基于其生物活性化合物的创新应用奠定了坚实基础。