不同磷有效性下接种土著溶磷菌对人参生长、人参皂苷生物合成及根际生态的调控

《Industrial Crops and Products》：Inoculation with native phosphate-solubilizing bacteria modulates growth, ginsenoside biosynthesis, and rhizosphere ecology of Panax ginseng under varying phosphorus availability

　　

为探究不同土壤磷水平下溶磷菌（PSB）对人参（Panax ginseng C. A. Mey.）的调控机制，研究人员从人参根际分离获得两株高效溶磷菌，并对其溶磷能力、分子鉴定及定殖特性进行了表征。采用双因素随机区组盆栽试验，设置4种接种处理与3个磷水平（P0、P1、P2），系统评估了单株与混合接种对人参生长、光合色素、根系活力、磷素吸收、人参皂苷积累、土壤磷组分、磷酸酶活性及根际细菌群落结构与功能的影响。结果表明，溶磷菌的效能因土壤磷状况而异：Bacillus subtilis N124在低磷条件下表现最佳，Ensifer adhaerens 53在中磷条件下效果最优，而混合菌群在各磷水平下均表现出最强且最稳定的促生效应。接种提高了土壤有效磷（AP）与微生物生物量磷（MBP），增强了酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（ALP）活性，并重塑了根际微生物群落结构。MBP和ALP与植株磷含量、光合色素、根系活力、生物量及多种人参皂苷（如Rg1+Re、Rf、Rc、Rb1）呈显著正相关，而土壤全磷（TP）与这些性状无显著相关。混合接种通过增强磷活化与根际群落重构发挥协同增效作用。研究结果揭示了溶磷菌介导的土壤–植物–微生物互作机制，为可持续人参栽培中磷管理与微生物策略的整合提供了科学依据。

人参（Panax ginseng C. A. Mey.）作为传统中药材，其脂溶性活性成分人参皂苷具有镇咳、降压、抗疲劳、抗肿瘤及降胆固醇等多种药理活性。由于土地过度开发与环境退化，野生人参种质资源日益稀缺，田间栽培人参已基本取代野生人参供应市场。然而，化肥和农药的广泛使用导致土壤退化严重，包括可溶性盐积累、土壤酸化、板结及结构恶化，改善根际土壤环境已成为人参栽培的关键问题。磷（P）是植物必需的大量元素，参与核酸合成、细胞分裂、组织发育、蛋白质生产及能量代谢等多种生理功能，对根系发育尤为重要。人参中补充磷可显著提高人参皂苷含量。然而，施入土壤的磷肥易与土壤阳离子结合形成难溶性沉淀，当季利用率仅约10%，造成显著经济和环境代价。土壤微生物在磷的生物地球化学循环中发挥关键作用，其中溶磷菌（PSB）可通过分泌有机酸溶解矿物磷酸盐、通过胞外磷酸酶水解有机磷化合物等机制将难溶性磷转化为植物可利用形态。已有研究表明，PSB的效能受土壤磷状况影响，混合菌群常因功能互补、交叉喂养和生态位分化而优于单一菌株，但人参体系中相关证据有限。

基于此，研究人员提出核心假设：PSB菌株的功能因土壤磷水平而异，混合菌群具有协同效应，能在不同磷环境下为人参生长和人参皂苷积累提供更稳健、更一致的益处，该协同作用可能通过增强溶磷及根际微生物群落结构与功能的改变来介导。研究目的包括：（1）探究单株与混合PSB接种在低、中、高土壤磷水平下对人参生长和人参皂苷合成的差异效应；（2）确定PSB介导的磷有效性提升是否由根际微生物群落及其功能谱的重构驱动；（3）评估混合菌群在稳定植株表现和土壤磷活化效率方面的协同效应。

研究人员从人参根际分离的210株菌株中，经有机和无机磷固体培养基初筛（以溶磷圈直径与菌落直径之比定义溶磷指数SI），选取前10株（无机磷SI 1.1–1.4，有机磷SI 1.3–1.9），其中7株具双重溶磷能力并进一步在摇瓶液体培养中定量，最终选取在无机磷培养基中溶磷最强的N124菌株及在两种培养基中均表现优异的53菌株，经16S rRNA基因序列系统发育分析鉴定N124为Bacillus subtilis、53为Ensifer adhaerens。采用扫描电镜（SEM）观察菌株在人参根表的定殖，并利用利福平抗性标记菌株定量根际种群密度。盆栽试验在延边大学试验站进行，基质由人参腐殖土、珍珠岩、蛭石和河沙按4:2:2:1（体积比）组成，采用双因素随机区组设计，4种接种处理（对照、EA、BS、MIX）与3个磷水平（以P?O?计0、25、50 mg/kg土壤，即P0、P1、P2）共12个组合，每处理3次重复。于移栽后115天采样，测定株高、根鲜重、光合色素、根系活力（TTC法）、植株全磷（钼蓝比色法）、人参皂苷含量（HPLC检测Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1）、土壤有效磷（AP）、全磷（TP）、微生物生物量磷（MBP）及酸性（ACP）、中性（NEP）、碱性（ALP）磷酸酶活性。同时提取根际土壤微生物基因组DNA，扩增细菌16S rRNA基因V3–V4区，基于Illumina HiSeq 2500平台测序，利用QIIME2进行序列质控、去噪和扩增子序列变异（ASV）生成，基于SILVA数据库进行物种注释，计算α多样性和β多样性，并进行PCoA分析、共现网络分析和基于KEGG的功能预测。

研究结果显示：在菌株筛选与鉴定方面，7株双重溶磷菌株均显著提高可溶性磷含量，达对照的8–18倍（无机磷）和9–18倍（有机磷），N124在无机磷培养基中溶磷最强，53和N124在两种培养基中均持续高表现，故被选为供试菌株。在定殖能力方面，SEM证实BS和EA均为杆状，接种苗根表可见与纯培养形态一致的细菌定殖，未接种对照根表无细菌定殖；利福平抗性标记平板计数显示两菌株均成功在根际建立种群，BSr密度（2.13×10⁶ CFU/g）略高于EAr（1.65×10⁶ CFU/g）。在植株表现与磷吸收方面，接种普遍促进人参表现，混合接种（MIX）效果最稳定；根生物量响应强于株高，MIX在各磷水平均显著提高根鲜重且持续高于相应单株处理，表明共接种对地下部生长具协同效应；BS在高磷（P2BS）下较对照显著提高株高。接种提高叶片总叶绿素含量，MIX在各磷水平均最高。低磷（P0）下所有接种处理均显著提高植株全磷，MIX增幅最大；根系活力在中等磷水平（P1）达峰值，MIX在各处理中最高。在人参皂苷积累方面，总皂苷含量以P1最高、P2次之、P0最低；各磷条件下混合接种的Rf、Rb1、Rb2和Rc含量均显著高于单株接种；P0下各单株处理Rg1+Re水平相当且显著高于对照；P1MIX对Rg1+Re、Rb1、Rb2和Rd的促进最强，P2MIX对Rf和Rc的促进最有效。在土壤磷库与磷酸酶活性方面，对照中有效磷以P1最高；各磷水平下接种普遍提高AP，低磷（P0）下MIX较P0Blank提高AP，高磷（P2）下所有接种处理AP均显著高于相应对照；TP主要反映磷投入，同一磷水平下接种未显著改变TP。MBP随磷供应增加而升高，接种在各磷水平均进一步提高MBP，MIX持续最高，超过单株接种和对照，表明共接种更强地刺激微生物磷固持与周转。接种整体提高磷酸酶活性，单株表现出酶特异性模式（EA倾向提高ACP/ALP/NEP，BS效应更依赖磷水平），MIX增强最强且最稳定，尤其对ACP和ALP。在土壤磷活化与人参表现的关联方面，相关性分析表明人参表现与生物活性/周转相关磷指标的关系比与土壤全磷更密切；MBP与ALP强正相关（r=0.953，p<0.01），二者与植株全磷、光合色素、根系活力和生物量等关键植株性状强正相关（r>0.86，p<0.01），并与Rg1+Re、Rf、Rc、Rb1等主要皂苷正相关（r=0.75–0.92，p<0.01）；TP与生长和皂苷相关性状无显著相关，表明TP相较磷活化指标是较差的人参生理与品质预测因子。在根际细菌多样性与群落变化方面，接种整体提高群落丰富度（ACE和Chao1），P2BS和P2MIX丰富度最高，P2Blank最低；Simpson指数无显著差异，Shannon指数在P2MIX最高、P1Blank最低。Venn图显示所有处理共享139个类群，提示存在核心群落；PCoA显示群落组成随处理明显偏移，前两轴分别解释34.27%（PCoA1）和27.01%（PCoA2）的变异，样本主要沿PCoA1按磷梯度分离，PCoA2反映与磷密切相关的接种差异；单株中EA在P1下群落偏移最强，BS在P0下效应明显，MIX在各磷水平位置相对稳定，表明其对整体群落结构影响较温和或具缓冲性。门水平上群落以Proteobacteria为主，其次为Acidobacteriota、Gemmatimonadota、Actinobacteriota和Patescibacteria；单纯加磷（Blank）伴随Proteobacteria/Acidobacteriota相对丰度下降和Firmicutes增加；接种以菌株特异性方式诱导门水平变化：EA倾向降低Gemmatimonadota和Bacteroidota而富集Proteobacteria/Acidobacteriota（尤其在高磷下），BS一般增加Proteobacteria和Bacteroidota而降低Gemmatimonadota，MIX持续降低Gemmatimonadota并增加Myxococcota，P2下Firmicutes明显增加。属水平上接种以磷依赖方式重塑群落：BS在P0下强烈富集Sphingomonas和未分类Sphingomonadaceae且随磷升高减弱；EA在多个磷水平富集未分类Xanthobacteraceae和未分类Chloroflexi等类群；Blank对照也表现磷驱动的内在变化，多个未分类类群在P1达峰，表明仅磷有效性即可重构根际微生物组。综上，磷供应设定主要群落梯度，接种菌进一步以磷依赖方式调节群落组成。在环境驱动、互作网络与功能潜力方面，冗余分析（RDA）表明磷供应与接种共同塑造根际细菌群落，门水平上RDA1主要沿磷梯度（P0 vs P2），RDA2捕捉接种相关变异并将EA与BS处理样本分开；属水平呈类似分离，P2Blank形成独立聚类，提示高磷不接种产生独特群落组成。相关性分析将特定类群与土壤性质关联：接种菌与不同细菌类群相关（EA与Actinobacteriota、BS与Proteobacteria、MIX与Myxococcota）；AP与Gemmatimonadota强负相关（r=?0.741），Gemmatimonadota与磷活化指标（AP、ALP、MBP）持续负相关；酶活性也与不同类群相关（如ACP与Myxococcota、NEP与Bacteroidota），支持磷库和磷酸酶活性是群落组装关键相关因子的观点。共现网络分析表明接种对群落互作的影响取决于磷供应：P0下各处理网络拓扑差异最大，P2下网络趋于相似且核心类群连通性降低，表明高磷削弱接种的构建效应；P1下网络呈中间模式，与中等磷可利用性下的过渡群落状态一致。基于KEGG注释的功能预测表明功能谱以代谢相关类别为主；加磷使预测功能向生长相关通路（如碳水化合物和核苷酸代谢）偏移并远离膜转运；接种也诱导处理特异性功能变化：EA与信号转导增加相关，BS富集氨基酸代谢，MIX同时增加信号转导和膜转运并降低若干代谢类别。

讨论部分指出，PSB效应强烈依赖土壤磷状况，混合菌群在各磷水平总体提供最一致的益处，P1+MIX整体响应最强，结果支持假设。PSB接种显著提高土壤AP但幅度取决于磷状况：P0下MIX的AP最高，P1下BS最有效，P2下所有接种均显著提高AP，提示菌株功能策略（如有机酸分泌与磷酸酶产生）可能随磷匮乏差异表达，土壤磷转化不仅受PSB菌株类型影响也受土壤原生磷状况影响，支持土壤性质调控微生物磷活化的观点。接种EA、BS和MIX进一步提高MBP且MIX效果最显著，可能因菌株间互补与协同建立更高效的根际磷活化循环，扩展和调动MBP库，提供更稳定持续的植物有效磷供应，促进人参生长和皂苷积累。磷相关酶活性对加磷呈不同响应模式：P2下NEP和ACP活性升高而ALP无响应，与Ikoyi等（2018）报道的ALP和ACP随磷增加均上升不同，凸显情境特异性土壤性质的影响。接种菌中EA提高ACP、ALP和NEP活性，BS显著提高ACP但效应随磷水平升高减弱，MIX的ACP和ALP活性高于单株或对照，提示菌群内细菌协同可能增强酶功能。接种EA和BS单株及组合动态重塑人参根际微生物群，改变其群落结构和功能，各接种菌诱导不同组成变化；门水平上Proteobacteria和Acidobacteria合计占群落的49.79–60.68%，RLV与Pseudolabrys和Ramlibacter相对丰度正相关，与近期研究一致，即Acidobacteriota对AP和ALP活性呈正响应，提示其在接种处理磷循环中的功能作用；某些Acidobacteria（如Candidatus Chloracidobacterium thermophilum）可能通过叶绿素生物合成增强植物–微生物互作，支持养分循环和植物生长；此外Ascomycetes、Actinobacteria和Firmicutes中的phoD基因可能参与碱性磷酸酶合成，表明群落内功能协同。属水平上土壤磷状况塑造分类群–磷关系和植物表现，但效应高度依赖情境；研究观察到TP/MBP/ALP与Sphingomonas负相关、TP/AP/ALP与Gemmatimona负相关，与Zou等（2023）报道的正相关相反，提示菌株特异性或环境依赖的功能角色，强调微生物对磷循环的贡献不能跨土壤或实验情境泛化。重要的是这些微生物变化反映在植物生理上：光合色素、根系活力和皂苷积累对磷水平和接种均有响应，未接种土壤高磷对照值最高，而中等磷结合EA、BS尤其MIX产生最高根系活力和皂苷含量，表明磷有效性与PSB接种存在协同互作，微生物益处在中磷而非磷饱和条件下最显著。光合色素增强依赖菌株和磷水平：EA以磷依赖方式提高类胡萝卜素和总叶绿素，BS持续增强类胡萝卜素，MIX最有效且显著优于单株，提示菌群内细菌协同可能通过优化溶磷和吸收更高效调节寄主生理，进而放大光合效率和能量同化，与PSB接种增强色素生物合成和根系活力从而促进整体生长的报道一致；其他物种中磷缺乏严重抑制叶片气孔发育、叶片磷浓度和光合效率，进一步凸显充足磷营养对维持光合能力和防止生物量损失的必要性。人参皂苷积累受磷有效性和微生物接种共同调控，存在清晰的磷–微生物–皂苷互作：总皂苷含量P1达峰、P2下降、P0最低，表明中等磷供应比过量或缺乏更利于皂苷生物合成，与Fang等（2025）报道磷改良后皂苷产量提高一致；研究进一步表明同一磷水平下混合接种较单株显著提高Rf、Rb1、Rb2和Rc，凸显两株本地分离菌对皂苷谱的协同和人参特异性效应；P0下单株接种使Rg1+Re高于对照但菌株间无差异，提示磷限制下单株面临功能约束而混合接种更适合克服瓶颈；P1MIX对Rg1+Re、Rb1、Rb2和Rd促进最强，P2MIX对Rf和Rc最有效，表明接种–磷互作可改变皂苷组成而非仅总含量。基于这些发现，研究人员提出生物接种剂尤其MIX增强人参生长和品质的机制路径：主要驱动似为根微生物群重构为更复杂合作的网络，促进与土壤酸性磷酸酶活性正相关的功能类群（如Myxococcota和未分类Xanthobacteraceae）；随之增强的磷矿化（由MBP、ALP与植株磷状况的强相关佐证）促进更优根系发育和光合能力；关键的是，这一生理提升通过增加光合输出提供必要碳骨架和能量，将资源导向负责皂苷生物合成的次生代谢途径，因此观察到的微生物变化不仅是相关性而是连接微生物群落动态与作物品质提升的因果级联的组成部分。

结论部分翻译：本研究阐明了PSB在不同土壤磷水平下调控人参生长、皂苷合成和根际微生物群落的机制。结果表明，不同PSB菌株提高土壤AP的效能取决于初始土壤磷状况，具体而言BS菌株在缺磷土壤中最有效，而EA菌株在P1条件下表现最佳。除直接溶磷外，PSB接种增强根系活力并促进特定人参皂苷的生物合成，尤其在P1条件下。关键的是，接种重塑了根际微生物组，促成有利于磷活化和代谢物积累的群落结构。值得注意的是，MIX菌群在多种磷水平下均取得稳健效果。这些发现凸显了依据特定土壤磷状况定制接种策略以最大化效益的重要性。最终，本研究提供了PSB介导的土壤–植物–微生物互作的机制见解，为可持续人参栽培中整合磷管理与微生物策略提供了科学依据。