由CS-(HMA-co-DEAEMA)水凝胶诱导的线粒体介导的细胞凋亡：一种基于壳聚糖的生物材料，对HT-29和HEK-293癌细胞具有选择性毒性

《International Journal of Biological Macromolecules》：Mitochondrial-mediated apoptosis induced by CS-(HMA-co-DEAEMA) hydrogel: A chitosan-based biomaterial exhibiting selective cytotoxicity toward HT-29 and HEK-293 cancer cells

　　

摘要

结肠直肠癌仍然是一个关键的治疗难题，需要开发出生物相容性和高效的治疗系统。在本研究中，通过使用戊二醛和过硫酸铵在水介质中，通过壳聚糖与N-羟甲基丙烯酰胺（HMA）和2-（二乙氨基乙基）甲基丙烯酸酯（DEAEMA）的化学交联，合成了基于壳聚糖的水凝胶，即CS-HMA、CS-DEAEMA和CS-(HMA-co-DEAEMA)。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和¹H NMR光谱证实了水凝胶的成功形成，而X射线粉末衍射（P-XRD）揭示了它们的晶体特性。CS-(HMA-co-DEAEMA具有高度多孔的互连网络，其孔径最大（17.069 ?），这一点通过扫描电子显微镜（SEM）和 BET分析得到了验证。热分析表明其稳定性增强，CS-(HMA-co-DEAEMA在290°C时仍能保持稳定，而流变学研究表明其储能模量和屈服点更优。膨胀研究显示，在pH 4.0、7.0和9.0时表现出不同的pH响应行为，其中CS-(HMA-co-DEAEMA水凝胶在酸性环境中膨胀最大，表明其适用于酸性肿瘤微环境。基于这些特性，选择了CS-(HMA-co-DEAEMA进行抗癌评估。该水凝胶对HT-29结肠直肠癌细胞表现出显著的细胞毒性（IC₅₀ = 125.582 ± 9.118 μg/mL），而对HEK-293正常细胞的毒性最小。DAPI染色显示了细胞核形态的变化，流式细胞术分析显示线粒体膜电位（ΔΨM）显著下降，HT-29细胞中有88.65%发生去极化，而对照组中这一比例为7.28%。这些发现表明CS-(HMA-co-DEAEMA能够诱导线粒体介导的细胞凋亡，显示出其作为进一步研究结肠直肠癌治疗中潜在生物材料的潜力。

引言

癌症仍然是一个重大的全球健康挑战，2022年全球报告的新病例约为2000万例，死亡人数约为970万例[1]，[2]。结肠直肠癌（CRC）是最常诊断出的癌症之一，也是癌症相关死亡的主要原因之一，全球新病例约为190万例，死亡人数约为90万例[3]，[4]。CRC发病率的增加，尤其是年轻患者病例数的增加，激发了人们对能够提高治疗效果同时减少传统治疗策略不良反应的治疗方法的需求[5]，[6]。基于生物材料的治疗平台在这一领域受到了广泛关注，因为它们可以与生物组织进行局部相互作用，控制治疗分子的运输，并对周围环境的变化做出响应。水凝胶特别具有吸引力，因为它们三维的聚合物网络可以保持大量水分，且其理化性质可以通过聚合物组成和交联来调节[7]，[8]，[9]。

天然聚合物因其在生物医学水凝胶开发中的生物相容性、可降解性、结构多样性和化学多功能性而受到广泛关注。多糖尤其具有吸引力，因为它们来源可再生，含有丰富的功能基团，并且可以进行化学修饰以适应特定的生物医学应用[7]，[10]。它们的亲水性及其结构适应性使其能够被开发成药物输送系统、伤口愈合材料、组织工程支架和基于水凝胶的平台[8]，[9]，[11]。这些特性支持了多糖基水凝胶在多种生物医学应用中的使用[7]，[8]，[9]。在天然多糖中，壳聚糖因其用于水凝胶制备而受到特别关注。壳聚糖是一种阳离子多糖，由几丁质脱乙酰化获得，含有β-(1→4)-连接的氨基和羟基糖单元。壳聚糖主链上的氨基（-NH₂）和羟基（-OH）基团提供了氢键形成、化学修饰和交联的位点，这对水凝胶网络的形成和稳定非常重要[11]。壳聚糖还具有抗菌和抗癌活性，使其在生物医学研究中具有重要意义[12]。它的化学反应性和生物特性促进了基于壳聚糖的水凝胶的不同网络结构和功能的发展。壳聚糖水凝胶已被研究用于癌症相关应用，因为它们可以提供水合基质，与生物组织进行局部相互作用，并控制治疗分子的运输。壳聚糖的氨基可以根据周围pH值发生质子化，从而影响膨胀、电荷密度、分子扩散和药物释放。基于壳聚糖的系统已被探索用于不同的癌症治疗策略，包括药物和基因输送、刺激响应疗法、光疗法和免疫疗法[12]，[13]。这些系统的性质和性能在很大程度上取决于水凝胶网络。交联密度、聚合物链相互作用、孔隙率和功能组分的掺入会影响机械强度、膨胀、降解和生物行为[14]。这些考虑因素促进了改性壳聚糖水凝胶的开发，其中引入了合成组分以调节天然聚合物网络的性质。最近关于基于壳聚糖的智能水凝胶的研究集中在机械强度、膨胀行为、结构完整性和对环境刺激的响应性等性质上[15]。基于壳聚糖的智能水凝胶也特别针对结肠直肠癌治疗进行了研究，报道的系统主要集中在刺激响应性和治疗剂的局部输送上[16]。这些研究表明，研究重点从单纯将壳聚糖用作可降解的水凝胶形成聚合物，转向开发具有可控理化和生物功能的网络。然而，壳聚糖的实际应用受到其在中性pH下的水溶性差、热稳定性低、凝胶形成能力弱、机械强度不足和降解迅速等限制。尽管如此，许多报道的系统主要是作为外部加载治疗剂的载体设计的。水凝胶基质对抗癌活性的直接贡献相对较少受到关注。掺入功能性合成单体为修改基于壳聚糖的水凝胶网络提供了一种有用的方法。N-羟甲基丙烯酰胺（HMA）含有酰胺和羟甲基基团，可以参与聚合物网络内的氢键相互作用，这些相互作用会影响水分吸收和亲水性水凝胶系统的行为[17]，[18]，[19]。2-（二乙氨基乙基）甲基丙烯酸酯（DEAEMA）含有三级胺基团，在酸性条件下可以发生质子化。其质子化状态的变化会改变聚合物网络的电荷和水合状态，导致pH依赖性的膨胀行为[20]。含有此类功能单体的水凝胶已被研究用于刺激响应和控制释放的应用[21]，[22]，[23]。HMA和DEAEMA为基于壳聚糖的网络提供了不同的但互补的功能。HMA可以提供亲水性和氢键相互作用，而DEAEMA可以通过其三级胺基团引入pH响应行为。它们在壳聚糖网络中的结合为调节水凝胶的结构和环境响应提供了合理的基础。

在基于壳聚糖的水凝胶设计中，实现机械稳定性、膨胀行为、结构完整性和环境响应性之间的适当平衡仍然是一个挑战。通过加入合成组分可以改善某些性质，但生成的网络可能在结构稳定性或功能响应性方面仍存在局限性[15]，[16]。结合结构稳定性、pH响应行为和内在生物活性的水凝胶可以为开发基于壳聚糖的抗癌材料提供不同的方法。在这方面，将HMA和DEAEMA同时掺入戊二醛交联的壳聚糖网络中是一种相关的材料设计策略。HMA的氢键和亲水性特性与DEAEMA的pH响应性三级胺功能相结合，为研究具有可调理化性质和直接生物活性的基于壳聚糖的水凝胶提供了机会。将HMA和DEAEMA一起用于结肠直肠癌治疗的水凝胶研究尚未得到充分关注。

本研究通过将N-羟甲基丙烯酰胺（HMA）和2-（二乙氨基乙基）甲基丙烯酸酯（DEAEMA）掺入戊二醛交联的壳聚糖网络中，开发了一种CS-(HMA-co-DEAEMA水凝胶。研究了该水凝胶的结构、热学、流变学和膨胀性质，以了解所加入单体的影响。对其针对HT-29人类结肠直肠腺癌细胞（HT-29）的生物活性进行了评估，同时使用HEK-293细胞评估其相对的细胞相容性。还研究了与该水凝胶抗癌活性相关的细胞反应。我们假设将HMA和DEAEMA与壳聚糖结合可以提供互补的化学功能，并调节最终水凝胶的结构和pH响应特性。进一步假设CS-(HMA-co-DEAEMA水凝胶将对HT-29细胞表现出抗癌活性，而对HEK-293细胞的毒性较低。

章节摘录

化学品

壳聚糖（分子量17,900 Da；通过GPC在DMF/LiCl中测定；脱乙酰程度88%通过¹H NMR确定[24]。图S1（Cal. S1）由HiMedia（印度孟买）提供）。醋酸、N-羟甲基丙烯酰胺（HMA）（48%水溶液）、2-（二乙氨基乙基）甲基丙烯酸酯（DEAEMA）（99%）、过硫酸铵（≥98%）、戊二醛（25% H₂O）和溴化钾（KBr）购自Sigma-Aldrich（美国）。所有实验均使用双蒸馏水。

FTIR分析

FTIR光谱用于确认壳聚糖（CS）与N-羟甲基丙烯酰胺（HMA）和2-（二乙氨基乙基）甲基丙烯酸酯（DEAEMA）的共聚反应，并研究所得水凝胶的结构变化（图1和S7-S9）。壳聚糖的FTIR光谱（图S1）在3465 cm^?1处显示一个宽峰，对应于重叠的-OH和-NH₂伸缩振动，以及在1653 cm^?1处的特征性酰胺-I（C=O）峰和2883 cm^?1处的-C-H峰。

结论

本研究成功验证了提出的假设，即将2-羟乙基甲基丙烯酸酯（HMA）和2-（二乙氨基）ethyl甲基丙烯酸酯（DEAEMA）合理掺入基于壳聚糖的水凝胶网络中，可以生成具有多功能性、pH响应性和机械稳定性的生物材料，并具有选择性的抗癌活性。FTIR、¹H NMR和XRD证实了成功的共聚整合和壳聚糖结晶度的降低，而SEM和BET分析揭示了多孔、互连的网络。

CRediT作者贡献声明

Ashlesha P. Kawale：撰写——原始草稿、软件、方法论、数据管理。 Anand Patel：撰写——原始草稿、软件、方法论、数据管理。 Shiwani Singh：研究、形式分析、数据管理。 Paramjeet Yadav：研究、形式分析、数据管理。 Nishant Shekhar：软件、形式分析、数据管理。 Arti Srivastava：监督、资源、方法论、概念化。 Arbind Acharya：撰写——审阅与编辑、验证。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

作者感谢Banaras Hindu University在IoE计划（编号6031）下提供的财政支持。

Ashlesha P. Kawale|Anand Patel|Shiwani Singh|Paramjeet Yadav|Nishant Shekhar|Arti Srivastava|Arbind Acharya|Rajesh Kumar|Neha Jain