支气管肺泡灌洗液细胞分类与间质性肺炎个体组织病理学特征的相关性研究

《PLOS One》：Bronchoalveolar lavage fluid cellular fractions reflect individual histopathological features in interstitial pneumonia

　　

专业术语翻译： 支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）细胞分析是间质性肺炎（interstitial pneumonia, IP）的辅助诊断工具，但其与个体组织病理学特征的关系尚不明确。研究人员对2005年至2020年间在单中心接受BALF检查和外科肺活检（surgical lung biopsy, SLB）的67例IP患者进行回顾性比较，分析BALF细胞分类与24项组织病理学特征的相关性。研究采用错误发现率（false discovery rate, FDR）校正（q < 0.05），随后进行多变量logistic回归分析和Kaplan–Meier生存分析。BALF淋巴细胞比例与成纤维细胞灶（fibroblastic foci）呈负相关（13.0% vs 29.0%，q = 0.002），与细支气管炎（q = 0.029）、腔内机化（q = 0.002）和上皮样细胞肉芽肿（q = 0.012）呈正相关。多变量分析显示，成纤维细胞灶与BALF淋巴细胞增多症（BALF lymphocytosis）可能性降低独立相关（比值比0.23，p = 0.018），且在排除具有寻常型间质性肺炎（usual interstitial pneumonia, UIP）或可能UIP模式患者以及特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）患者后，该关联仍然存在。腔内淋巴细胞增殖也与BALF淋巴细胞增多症相关，但该估计基于少数患者。存在成纤维细胞灶的患者生存期较差（p = 0.003），而按BALF淋巴细胞比例分层时生存期无显著差异。受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线分析确定BALF淋巴细胞18.5%为预测成纤维细胞灶存在的最佳截断值（AUC 0.76），将BALF淋巴细胞比例加入高分辨率计算机断层扫描（high-resolution computed tomography, HRCT）模式可改善成纤维细胞灶的判别能力（AUC 0.847 vs 0.686）。中性粒细胞和嗜酸性粒细胞比例经校正后未显示显著相关性。BALF淋巴细胞比例与IP中多项组织病理学特征相关，其中与成纤维细胞灶的关联最强，在外科肺活检不可行时可能提供补充信息。

论文解读文章

一、研究背景与目的

特发性间质性肺炎是一组异质性呼吸系统疾病，包含多种亚型，每种亚型以肺间质的不同病理受累为特征。特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）预后较差，是一种进行性慢性纤维化间质性肺病（interstitial lung disease, ILD），组织病理学上以寻常型间质性肺炎（usual interstitial pneumonia, UIP）模式为特征。其他ILD亚型包括非特异性间质性肺炎（nonspecific interstitial pneumonia, NSIP）和结缔组织病相关ILD（connective tissue disease-associated ILD, CTD-ILD）。此外，还存在不可分类的间质性肺炎，反映UIP和NSIP模式的重叠特征。对于此类非典型或不可分类的间质性肺炎（interstitial pneumonia, IP），需要通过全面的多学科讨论（multidisciplinary discussion, MDD）进行谨慎评估才能明确疾病分类。

外科肺活检（surgical lung biopsy, SLB）被认为是ILD患者病理诊断的金标准，但其高侵入性仍是主要问题。近年来，经支气管肺冷冻活检被用作SLB不可行时的替代方法，但存在出血等并发症风险，其诊断价值仍有争议。对于无法进行侵入性诊断操作的患者，通过支气管镜获得的支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）分析结果常与影像学和临床特征一起作为补充诊断信息。

BALF细胞分析被推荐作为ILD的辅助诊断工具，其在多种疾病实体中的临床价值已有报道，包括过敏性肺炎和结节病。此外，既往研究表明BALF细胞分类可能对IPF患者具有预后价值，BALF淋巴细胞比例升高可能反映非IPF的ILD对类固醇治疗的反应性。然而，尽管BALF在ILD中的价值已获认可，BALF细胞谱与个体肺组织病理学特征之间的关系尚未得到明确定义。既往研究主要集中于病理模式间的比较或最终诊断的确定，而非对特定肺组织病理学特征与BALF细胞分类之间关联的系统性详细评估。本研究旨在阐明IP患者肺部组织病理学特征与BALF发现之间的关系。如果BALF细胞谱与个体肺组织病理学特征相关，BALF分析可为这些特征提供补充信息，特别是在不可分类IP中，因为此类病例无法进行基于指南的模式分类，明确诊断仍具挑战性。

二、研究设计与方法

本研究为单中心回顾性研究，于2005年7月至2020年1月期间在日本东邦大学大森医疗中心筛选了98例同时接受BALF分析和SLB评估ILD的患者，排除7例BALF数据缺失、1例SLB数据缺失、1例BALF分析失败、6例BALF与SLB之间疾病进展以及16例最终诊断非IP的患者后，最终纳入67例连续患者。

所有患者均使用标准柔性纤维支气管镜（BF-1T260，外径5.9 mm，Olympus，东京，日本）进行检查。支气管镜楔入受影响的肺段支气管，或舌段或右中叶支气管。注入无菌生理盐水2–4等份，每份50 mL，总量100–200 mL。BALF样本通过密度梯度离心处理，细胞离心涂片经Wright-Giemsa染色进行分类计数，BALF淋巴细胞T细胞表型采用流式细胞术分析。

所有患者均接受常规CT扫描（层厚5–10 mm）和薄层高分辨率CT（high-resolution computed tomography, HRCT）（层厚1.0 mm）检查。HRCT图像由三位肺科医生（S.M.、S.S.和S.H.）独立评估，对患者临床信息设盲。HRCT模式根据ATS/ERS/JRS/ALAT声明分为四类：UIP、可能UIP、UIP不确定和替代诊断。肺组织标本从至少两个不同部位通过SLB获取，组织病理学评估在苏木精–伊红染色和Elastica van Gieson染色切片上进行，组织病理学模式采用相同的ATS/ERS/JRS/ALAT分类。此外，系统评估了24项肺组织病理学特征，每项特征记录为存在或不存在。所有24项特征由一名病理学家（S.H.）和一名接受过病理学培训的肺科医生（Y.N.）独立审查，最终病理诊断由两位评估者协商确定。最后，由三位肺科医生和一位病理学家进行多学科讨论，综合所有可用临床信息确定临床诊断。

统计学方面，分类变量采用Pearson卡方检验或Fisher精确检验比较，连续变量采用Mann–Whitney U检验或Kruskal–Wallis检验比较。为控制24项组织病理学特征分析中的多重比较，采用Benjamini、Krieger和Yekutieli逐步上升法进行错误发现率（false discovery rate, FDR）校正，统计显著性定义为q < 0.05。构建logistic回归模型识别与BALF淋巴细胞比例相关的因素，根据10个事件每变量限制，选择单变量分析中p值最小的三个变量进入多变量模型。采用Firth惩罚最大似然估计作为敏感性分析。BALF淋巴细胞增多症采用2012年美国胸科学会临床实践指南的15%阈值定义。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线分析确定预测成纤维细胞灶存在的最佳BALF淋巴细胞截断值。生存分析采用Kaplan–Meier方法和log-rank检验，中位随访时间采用逆Kaplan–Meier方法估计。为评估BALF细胞分类是否增加放射学信息，拟合logistic回归模型并采用DeLong检验比较ROC曲线下面积（area under the curve, AUC），进行2000次重复的自举乐观校正。

三、研究结果

1. 1.
   患者基线特征与病理学特征

共纳入67例IP患者，男34例，女33例，中位年龄64岁。BALF采集时无患者接受IP治疗（包括免疫抑制治疗）。BALF中位回收率为53%（四分位距[IQR]，47–61%）。中位细胞分类比例为：巨噬细胞68%（IQR，34–79%），中性粒细胞4%（IQR，1–7%），淋巴细胞21%（IQR，8–34%），嗜酸性粒细胞3%（IQR，1–6%）。HRCT方面，可能UIP模式10例，UIP不确定12例，替代诊断45例，无患者符合HRCT确定UIP标准。组织病理学模式方面，UIP 2例，可能UIP 9例，UIP不确定12例，替代诊断44例。最终诊断包括IPF 9例、NSIP 19例、不可分类IP 23例、CTD-ILD 9例和慢性过敏性肺炎（chronic hypersensitivity pneumonitis, CHP）7例。最常见的病理学特征为肺泡炎和纤维化（各n = 62，92.5%），肺大疱最少见（n = 2，3.0%），其次为胸膜疾病和血管内皮肥大（各n = 3，4.5%）。

1. 2.
   BALF淋巴细胞比例与组织病理学和CT发现的关系

将BALF淋巴细胞比例与SLB获得的肺组织病理学进行比较，成纤维细胞灶与BALF淋巴细胞比例呈显著负相关（中位数，13.0% vs 29.0%；q = 0.002）。相反，细支气管炎（中位数，29.0% vs 14.0%；q = 0.029）、腔内机化（中位数，48.0% vs 14.0%；q = 0.002）和上皮样细胞肉芽肿（中位数，71.5% vs 18.0%；q = 0.012）呈正相关。按组织病理学模式分层时，UIP或可能UIP患者的BALF淋巴细胞比例显著低于UIP不确定或替代诊断模式患者（中位数，6.0% vs 22.5%；p = 0.023）。按HRCT模式分层时，可能UIP组的BALF淋巴细胞比例低于替代诊断组（中位数，5.5% vs 21.0%；p = 0.045）。排除UIP或可能UIP模式患者（14.0% vs 29.0%，n = 56，p = 0.002）和排除IPF患者（13.0% vs 29.0%，n = 58，p = 0.001）后，成纤维细胞灶仍与较低的BALF淋巴细胞比例相关。在19例特发性NSIP患者中同样观察到该关联（13.0% vs 32.5%，p = 0.006），而23例不可分类IP患者中观察到类似趋势但未达统计学显著性（p = 0.067）。在预测成纤维细胞灶存在的logistic回归模型中，HRCT模式单独AUC为0.686，BALF淋巴细胞比例单独AUC为0.764，联合模型AUC为0.847。联合模型AUC显著高于单独HRCT模式（DeLong p = 0.005），自举校正后AUC为0.827。

1. 3.
   与BALF淋巴细胞增多症相关的多变量分析

根据2012年美国胸科学会临床实践指南，采用BALF淋巴细胞比例≥15%定义BALF淋巴细胞增多症。单变量分析中，BALF淋巴细胞增多症与成纤维细胞灶存在[42.1%（16/38）vs 82.8%（24/29）；p = 0.001]、细支气管炎[36.8%（14/38）vs 10.3%（3/29）；p = 0.022]、腔内机化[42.1%（16/38）vs 10.3%（3/29）；p = 0.006]、上皮样细胞肉芽肿[15.8%（6/38）vs 0%（0/29）；p = 0.032]和腔内淋巴细胞增殖[36.8%（14/38）vs 6.9%（2/29）；p = 0.008]显著相关。多变量logistic回归分析中，成纤维细胞灶与BALF淋巴细胞增多症可能性降低独立相关（比值比[odds ratio, OR] 0.23，95% CI 0.06–0.78，p = 0.018）。腔内淋巴细胞增殖与BALF淋巴细胞增多症可能性升高相关（OR 5.25，95% CI 1.12–38.21，p = 0.035），但基于淋巴细胞增多症组14例和非淋巴细胞增多症组2例患者。在包含单变量检验中全部五个显著变量的Firth惩罚模型中，成纤维细胞灶保留显著关联（OR 0.29，95% CI 0.08–0.97，p = 0.045），其余估计不稳定。将组织病理学模式加入模型后，成纤维细胞灶与BALF淋巴细胞增多症的关联仍保留（OR 0.27，95% CI 0.07–0.95，p = 0.041）；将IPF最终诊断加入模型后同样保留（OR 0.22，95% CI 0.06–0.79，p = 0.019），而模式项和诊断项本身均不显著。采用18.5%阈值作为结局的敏感性分析中，成纤维细胞灶仍与淋巴细胞增多症可能性降低相关（OR 0.17，95% CI 0.04–0.58，p = 0.004），腔内淋巴细胞增殖与可能性升高相关（OR 6.60，95% CI 1.40–48.50，p = 0.016），方向与主要分析一致。

1. 4.
   根据组织病理学特征和BALF淋巴细胞增多症的生存分析

Kaplan–Meier生存分析显示，存在成纤维细胞灶的患者预后显著较差（log-rank检验，p = 0.003），而腔内淋巴细胞增殖未观察到显著生存差异（log-rank检验，p = 0.080）。随访期间67例患者中19例死亡，包括40例成纤维细胞灶阳性患者中的16例（40.0%）和27例阴性患者中的3例（11.1%）。成纤维细胞灶存在时中位生存期为8.3年，不存在时未达到。逆Kaplan–Meier方法估计的中位随访时间为7.5年，观察随访范围为0.2至15.9年。鉴于成纤维细胞灶的预后意义，进行ROC曲线分析确定预测其存在的最佳BALF淋巴细胞比例，最佳截断值为18.5%（AUC 0.763，95% CI：0.646–0.882，敏感性65.0%，特异性81.5%）。BALF淋巴细胞增多症（≥18.5%）与非淋巴细胞增多症（<18.5%）患者之间的总生存期无统计学显著差异（log-rank检验，p = 0.104）。淋巴细胞增多症组（3/36，8.3%）与非淋巴细胞增多症组（6/31，19.4%）的IPF患者比例无显著差异（p = 0.284）。BALF采集和SLB后皮质类固醇使用在两组间无显著差异（63.9% vs 48.4%，p = 0.226）。采用指南15%阈值时，总生存期也无显著差异（p = 0.413）。

1. 5.
   BALF中性粒细胞或嗜酸性粒细胞比例与组织病理学特征的关联

将BALF中性粒细胞和嗜酸性粒细胞比例与SLB标本获得的肺组织病理学特征进行比较，未发现组织病理学特征与BALF中性粒细胞比例显著相关。相反，血管内皮肥大与BALF嗜酸性粒细胞比例呈正相关（中位数，21.0% vs 3.0%；q = 0.038），但该特征仅存在于3例患者中。

1. 6.
   BALF细胞分类与最终诊断的关系

BALF淋巴细胞比例在五种最终诊断之间无显著差异（p = 0.306）。中位值分别为：IPF 6.0%，特发性NSIP 21.0%，不可分类IP 20.0%，CTD-ILD 22.0%，CHP 67.0%。将IPF与其他诊断合并比较时，差异方向符合预期但未达显著性（6.0% vs 22.0%，p = 0.068），判别能力有限（AUC 0.691）。在HRCT模式非可能UIP的57例患者中，仅3例为IPF，判别能力更低（AUC 0.657，Mann–Whitney p = 0.371）。放射学模式与最终诊断在7例患者中不一致。4例HRCT为可能UIP模式但最终诊断非IPF的患者中，BALF淋巴细胞比例为5.0%、8.0%、5.0%和78.0%；三个较低值与6例HRCT可能UIP模式且最终诊断为IPF患者观察到的5.5%中位数无法区分，而单例显著淋巴细胞增多症患者最终诊断为CHP且组织学上存在上皮样细胞肉芽肿。3例HRCT模式非可能UIP的IPF患者中，BALF淋巴细胞比例为5.0%、16.0%和23.0%。这些数字过小，不足以支持推断。

四、讨论与结论

本研究观察到BALF淋巴细胞比例与肺成纤维细胞灶之间存在显著负相关。多变量分析中，成纤维细胞灶与低BALF淋巴细胞比例独立相关（OR 0.23，95% CI 0.06–0.78）。腔内淋巴细胞增殖显示相反方向的类似关联，但估计基于少数患者，应视为探索性（OR 5.25，95% CI 1.12–38.21）。成纤维细胞灶与较差生存期密切相关，符合其在IP中已确立的预后意义。这些结果表明BALF细胞分类与个体组织病理学特征相关，特别是成纤维细胞灶的存在，因此在无法获得组织学材料时可提供补充信息。

既往尚无研究系统比较BALF细胞分类与特定肺组织病理学特征。本研究确定了BALF淋巴细胞比例与成纤维细胞灶存在之间的显著负相关，成纤维细胞灶是UIP的关键组织病理学特征。多项既往研究报道成纤维细胞灶与IP患者不良预后密切相关。在UIP和NSIP中，成纤维细胞灶数量或范围越大与临床结局越差相关。在CHP中，成纤维细胞灶负荷与预后显著相关。在不可分类IP中，快速进展性疾病以较高比例的成纤维细胞灶和较差生存期为特征。在原发性干燥综合征相关ILD中，成纤维细胞灶严重程度也与预后相关。这些发现强调成纤维细胞灶是纤维化和慢性ILD中共有的稳健预后因素，无论病因或放射学模式如何。识别成纤维细胞灶的存在因此与ILD预后评估相关，本研究结果提示BALF细胞分析可为此评估贡献补充信息。

成纤维细胞灶是UIP模式的定义性特征，低BALF淋巴细胞比例在UIP和IPF中均已获公认。然而，本队列中成纤维细胞灶的分布表明该解释并不充分。40例成纤维细胞灶阳性患者中，29例组织病理学模式非UIP或可能UIP，31例最终诊断非IPF。该关联在分层分析中仍维持，包括替代组织病理学模式患者和特发性NSIP患者。在分别调整组织病理学模式和IPF最终诊断的模型中仍显著，尽管这些调整可能因定义重叠导致过度调整。分层分析因此是更具信息量的比较，提示该关联不太可能仅由UIP模式或IPF诊断解释。

BALF回收的解剖来源仍未完全明确，尚不清楚BALF主要来源于并采样外周肺泡区域还是更中央的细支气管气腔。由于具体采样区室尚未直接确定，BALF发现是否准确反映肺泡或间质病理仍不确定。本研究结果部分支持这种不确定性：BALF淋巴细胞比例与间质病理特征（肺泡炎、淋巴滤泡、淋巴样增生）无关联。相反，多变量分析显示腔内淋巴细胞浸润与BALF淋巴细胞比例显著相关。这些发现提示一个关键区别——BALF可能不能准确反映间质病变内的细胞增殖，而是优先采样肺泡腔内存在的细胞。因此，BALF组成可能更密切反映肺泡腔内而非间质内的细胞含量。这可能解释BALF与腔内而非间质淋巴细胞浸润相关的原因。

BALF淋巴细胞比例与IP预后的关系仍有争议。部分研究报道BALF淋巴细胞增多症与UIP患者较好预后相关，其他研究未发现BALF淋巴细胞增多症与生存期显著相关。本队列中，BALF淋巴细胞比例≥18.5%与较低值患者之间未发现显著生存差异。缺乏统计学显著性可能归因于多种因素，包括相对较小的样本量（n = 67）可能限制统计效力，以及本研究纳入的IP亚型异质性。与仅关注UIP的研究相比，本队列包含多种IP亚型，可能导致结果稀释。此外，多变量分析中根据ATS指南采用15%的BALF淋巴细胞增多症截断值，但该阈值对异质性IP队列的适用性仍不确定。鉴于本研究中BALF淋巴细胞比例与成纤维细胞灶之间的强负相关，以及成纤维细胞灶已确立的预后意义，需要更大规模的多中心研究进一步阐明BALF淋巴细胞增多症在IP中的预后价值。

两种生存分析之间的对比值得关注。按组织学特征本身分层清晰分离了生存曲线，而按BALF淋巴细胞比例分层未实现分离，无论采用18.5%阈值（p = 0.104）还是指南15%阈值（p = 0.413）。BALF淋巴细胞比例判别成纤维细胞灶的能力为中等，AUC为0.763，18.5%阈值时敏感性为65.0%，表明约三分之一的成纤维细胞灶阳性患者无法被识别。这些观察提示BALF细胞分析仅提供关于成纤维细胞灶存在的部分信息，不太可能替代预后评估中的组织学信息。

BALF淋巴细胞比例在本队列中未能区分五种最终诊断，也未能解决HRCT模式与最终诊断不一致的病例。相反，它与所检查的诊断类别中的成纤维细胞灶相关。既往研究将BALF发现与组织病理学模式或最终诊断进行比较，本研究结果提示特定组织学特征可能提供更具信息量的比较对象。该观察基于单一队列中的单一组织学特征，需在独立研究中确认。

成纤维细胞灶与BALF淋巴细胞比例之间的负相关提示BALF细胞组成可能确实间接反映肺泡病理，而非直接通过肺泡区域采样。既往研究表明，IP患者的成纤维细胞可抑制T细胞增殖、诱导T细胞凋亡并抑制淋巴细胞迁移。这些发现提示肺内病理性成纤维细胞增殖可能导致BALF中淋巴细胞耗竭。相反，T淋巴细胞已被证明在成纤维细胞清除中发挥作用，提示T淋巴细胞数量减少可能损害成纤维细胞清除，从而促进异常成纤维细胞灶增殖的持续或进展。本研究中BALF淋巴细胞比例与肺成纤维细胞灶之间的负相关与这些既往报道一致。然而，该关系的方向性和因果性，即淋巴细胞数量减少是否促成成纤维细胞灶形成还是相反，仍有待确定。

研究存在以下局限性：首先，这是单中心回顾性研究，队列相对较小，主要由需要SLB的患者组成，不能排除选择偏倚，发现可能不具普适性；分析为探索性而非预设，模型在同一队列中开发和评估，未进行外部验证。其次，BAL在不同肺段进行，两种操作间隔中位数为43天，两个标本可能不代表相同疾病状态。BAL时无患者接受间质性肺炎治疗，且排除了操作间有记录进展的患者，但间隔期间的变化不能排除。第三，组织病理学特征记录为存在或不存在，无法检查各特征程度与关联；若干特征仅在极少数患者中观察到，涉及血管内皮肥大、胸膜疾病、肺大疱和上皮样细胞肉芽肿的关联应视为假设生成。一名评估者也参与了放射学评估、组织病理学评估和多学科讨论，尽管放射学和组织病理学审查在去标识化材料上分别进行，但无法保证评估完全独立。最后，治疗未标准化，未收集系列肺功能数据，无法检查BALF细胞分类与治疗反应之间的关系。需要进一步的前瞻性多中心研究验证这些发现并阐明BALF细胞分析作为IP组织病理学评估补充工具的临床价值。

研究结论：本研究证明BALF细胞分类与IP中特定组织病理学特征相关，最显著的是BALF淋巴细胞比例与成纤维细胞灶之间的负相关，该关联在各诊断类别中持续存在。鉴于成纤维细胞灶在多种ILD亚型中具有预后意义，BALF细胞分析在外科肺活检不可行时可提供组织病理学特征的补充信息。然而，本研究中观察到的中等判别性能表明BALF不太可能替代组织学评估。