qPCR实验中最容易被忽略的10个问题：从Ct值异常到重复性差，一次讲清楚（下）

实时荧光定量PCR（qPCR）是分子生物学实验室中最常用的核酸检测技术之一。基因表达、病原体检测、转基因分析、SNP分型等实验都离不开该技术的使用。

而qPCR实验中遇到的问题是五花八门。在这个系列的（上）中提到的最容易被忽略的10个问题：

• 为什么同一样本重复孔Ct值相差很大？

• Ct值差1个循环，到底意味着什么？

• NTC出现扩增，到底是污染还是引物二聚体？

• 扩增曲线不是漂亮的“S型”，实验还能用吗？

• 熔解曲线出现多个峰，说明什么？

• 为什么PCR扩增效率只有70%？

• 为什么换了仪器后Ct值发生变化？

• 为什么有时候只有几个孔异常？

• 为什么多重qPCR比普通qPCR更难？

我们已经对部分问题给出了排查思路（qPCR实验中最容易被忽略的10个问题：从Ct值异常到重复性差，一次讲清楚（上））。现在让我们一起来看剩下的问题应该如何解决。

06｜为什么PCR扩增效率只有70%

扩增效率是评价qPCR体系的重要指标。如果标准曲线显示扩增效率明显偏低，首先应该从实验体系寻找原因。常见因素包括：

引物

• 设计不合理；

• 特异性不足；

• Primer-dimer。

模板

• 降解；

• 浓度不合理；

• 存在PCR抑制物。

反应体系

• 引物浓度；

• Mg²⁺条件；

• Master Mix；

• 反应体积。

PCR程序

• 退火温度；

• 延伸时间；

• 循环条件。

此外，标准曲线的模板梯度设置也非常重要。不要为了得到一个“漂亮的扩增效率”而人为调整数据。真正可靠的方法，是找到影响扩增效率的实验变量并进行优化。

07｜为什么同一批样本，换一台qPCR仪后Ct值变了？

这是一个非常容易被忽略的问题。qPCR仪并不是单纯的“PCR扩增器”。完整的实时荧光PCR检测实际上包括：

温度控制

↓

PCR扩增

↓

荧光激发

↓

荧光采集

↓

数据处理

↓

Ct计算

不同仪器在温控、光学系统、信号采集以及数据处理等方面存在差异，因此同一个样本在不同平台上获得的Ct值并不一定完全一致。

因此，如果实验项目需要长期进行纵向比较，建议尽量保持：

• 同一仪器；

• 同一PCR程序；

• 同一试剂体系；

• 一致的数据分析方法。

这样可以减少不必要的系统误差。

08｜为什么有时候只有几个孔异常？

如果同一块96孔板中，大部分孔都正常，只有少数几个孔明显异常，不要直接认为是生物学差异。

首先可以检查：

① 加样

是否存在移液误差？

② 气泡

反应液中是否存在气泡？

③ 封板

封膜是否压紧？

④ 孔位

异常孔是否集中在特定区域？

⑤ 仪器

是否存在孔间温度或光学检测一致性问题？这一点很重要。因为如果异常孔具有明显的位置规律，就应该进一步考虑是否存在仪器相关因素，而不能全部归因于样本。

09｜为什么多重qPCR比普通qPCR更难？

多重qPCR可以在同一个反应体系中检测多个靶标，从而节省样本、试剂和时间。但同时也增加了实验复杂度。

例如：

靶标A → FAM

靶标B → VIC/HEX

靶标C → ROX

靶标D → Cy5

此时不仅需要考虑不同靶标之间的引物竞争，还需要考虑不同荧光信号之间的光谱区分。

因此，多重qPCR对仪器的：

• 荧光通道；

• 光学系统；

• 信号采集；

• 串色控制；

提出了更高要求。

所以：多通道并不等于简单地增加几个检测通道，而是对整个检测系统提出了更高要求。

qPCR仪到底应该怎么选？

到了采购阶段，很多实验室会直接比较：

“A品牌几个通道？”

“B品牌升温速度多少？”

但如果真正从实验角度出发，更建议按照下面几个维度判断。

温控关注：

• 温度准确性；

• 温度均一性；

• 升降温速度；

• 长时间运行稳定性。

光学关注：

• 荧光通道数量；

• 检测能力；

• 信号稳定性；

• 多重检测能力。

通量根据实际实验需求选择：

• 48孔；

• 96孔；

• 384孔；

• 独立模块化平台。

天隆科技 

天隆Gentier系列：让仪器成为实验稳定性的保障，而不是变量

当样本、引物、试剂和操作流程已经标准化后，仪器本身就是需要重点关注的变量之一。

天隆科技Gentier系列荧光定量PCR仪，围绕实时荧光PCR的核心检测流程，对温控、荧光检测和数据分析进行系统设计。针对不同实验需求，Gentier系列提供不同通量和模块化产品方案：

Gentier Sp96

采用CMOS拍照成像技术，并提供多通道荧光检测方案，可满足高通量、多重检测等应用需求。

Gentier 96系列

面向常规科研及检测应用，适合基因表达、病原检测、基因分型等实验。

Gentier X3系列

采用32×3独立模块设计，不同模块可独立运行不同PCR程序，适合多个实验项目并行开展的实验室。

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从实验需求出发：如何选择真正适合你的荧光定量PCR仪

qPCR实验中，真正让实验人员反复排查的，往往不是“有没有扩增”，而是：

o 为什么这一次和上一次不一样？

o 为什么Ct变了？

o 为什么重复孔不一致？

o 为什么扩增曲线异常？

o 为什么换一台仪器结果又变了？

这些问题背后，往往不是单一因素造成的。

从样本到试剂，从操作到PCR程序，再到温控、光学检测和数据分析，每一个环节都可能影响最终结果。所以，做好qPCR的关键，不只是“把PCR跑出来”。而是：

让每一次扩增都尽可能在一致的条件下发生，让每一个荧光信号都被稳定地检测，让最终得到的每一个Ct值，都有可靠的实验依据。这才是qPCR真正的“可重复性”。

下一次遇到Ct值异常时，不妨从这9个问题开始排查。

基因有限公司和天隆科技合作以来，致力于为您打造实验室全套方案。无论是分子、细胞，还是组学、育种，均为您准备了全套的方案。如果您感兴趣，请扫码联系我们的工作人员吧。