评估荷斯坦公牛精子DNA甲基化组对生育力的机器学习预测潜力

《Genetics Selection Evolution》：Assessing the predictive potential of the Holstein bovine sperm methylome for bull fertility using machine learning

背景：公牛生育力是奶牛产业的关键参数，具有重要经济意义。DNA甲基化（DNA methylation）是生育力所必需的表观遗传标记，近期研究提示精子DNA甲基化是男性生育力生物标志物的有前景来源，但尚无基于DNA甲基化预测公牛生育力的可操作工具。研究人员利用已有甲基化数据，评估DNA甲基化通过机器学习模型预测公牛生育力的潜力。结果：本研究在351头荷斯坦商业化公牛队列中开展，依据田间生育力指数——授精后56 d受配母牛的非返还率（non-return rate，NRR₅₆）——将公牛分为低生育力、中性和高生育力。该数据集为基于表观遗传标记进行公牛生育力预测所构建的最大队列。研究人员利用冷冻精液获得的简化代表性亚硫酸氢盐测序（reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）数据衍生的一组预测变量，建立分类模型以区分低生育力和高生育力个体。比较了四种机器学习算法：最小绝对收缩和选择算子（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）、随机森林（random forest，RF）、梯度提升（gradient boosting，GB）和神经网络（neural network，NN）。为优化各算法性能并对分类准确率进行无偏评估，研究人员在最终于独立测试集测试前采用三折交叉验证（cross-validation，CV）。为增强结果稳健性，模型性能在20次训练集与测试集数据划分上取平均，以考虑公牛在不同集合中分布的变异性。所有模型均优于随机分类。根据独立测试集计算，按分类准确率（0.62）最佳模型为LASSO，按曲线下面积（area under curve，AUC；0.69）最佳模型为RF。结论：即使性能中等，这些模型仍可使识别低生育力个体的概率提高12.4个百分点。这些结果提示，精子DNA甲基化有潜力成为公牛生育力的相关预测标志物来源。

一、研究背景与问题
人工授精（artificial insemination，AI）使用冷冻精液是奶牛繁殖的常用方式，维持较高AI成功率对产业可持续性十分重要。低生育力公牛会增加妊娠失败、提高淘汰率、降低遗传进展，并给养殖者和育种公司造成经济损失。已有研究利用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）建立统计模型预测荷斯坦、Jersey和Brown Swiss等品种公牛生育力，但相关研究多基于线性高斯模型，观测值与预测值相关系数为0.28—0.40，仅捕获生育力的遗传成分，预测能力中等。精子形态或核形状预测研究虽报告较高R²或准确率，但样本量很小（n≤17），难以推广。DNA甲基化对生育力至关重要，Dnmt3l或Dnmt3a条件性敲除可导致雄性不育、减数分裂停滞及精原干细胞分化失败；宫内不良环境暴露可改变成熟精子DNA甲基化并损害成年生育力。人类研究基于127例不孕个体和54例可育正常精子男性报告82%敏感性，但无独立测试集，性能可能高估。牛精子DNA甲基化研究近期增多，但样本量多为9—28头，仅识别差异甲基化区域，未开发预测模型；Costes et al.在100头Montbéliarde公牛中采用RF达到72%分类准确率，并在20头独立队列中复制，但仍受小数据集和有限算法限制。因此，研究人员利用351头Holstein商业公牛，采用严格评估流程，比较多种机器学习模型，以评估精子DNA甲基化预测公牛生育力的潜力及其对AI可靠性的潜在价值。
二、研究开展、结论与意义
研究人员建立分类模型区分低生育力与高生育力公牛，发现所有模型均优于随机分类；最佳LASSO模型分类准确率为0.62，最佳RF模型AUC为0.69。尽管性能中等，最佳模型可使识别低生育力个体的概率较随机分类提高12.4个百分点。结果提示精子DNA甲基化有潜力作为公牛生育力的预测标志物来源，但仍不足以完全预测复杂生育力表型；在大型育种项目中，提高低生育力公牛识别能力可能带来经济收益。
三、关键技术方法（不超过250字）
队列为351头法国两家育种公司的商业Holstein公牛，共664份冷冻精液样本；以校正多种固定效应及母牛遗传和永久环境效应后的NRR₅₆定义生育力，按中位数±0.5分或±1分划分低生育力、中性、高生育力。RRBS数据与RUMIGEN EpiChip交集为21,182个CpG（胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点），技术过滤后保留14,285个CpG；构建1分差距（246头公牛）和2分差距（160头公牛）数据集。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）生成471或305个主成分（principal components，PCs）作为预测变量。比较LASSO、RF、GB、NN四类算法；80%/20%划分训练集和测试集并重复20次，训练集内五重复三折CV调参，独立测试集评估准确率、敏感性、特异性、AUC；采用非参数检验、Dunn检验、阳性预测值（positive predictive value，PPV）、学习曲线及CpG遗传力分析。
四、研究结果
（1）遗传与年龄混杂因素评估（Assessment of genetics and age as confounders）：通过计算全队列两两基因组亲缘系数，发现组内关系值与组间值相近，无系统性富集或群体分层；通过Wilcoxon检验和分位数—分位数分析，发现1分和2分NRR₅₆差距定义下训练集与测试集年龄分布均无显著差异（p>0.01）；两家来源公司间NRR₅₆和年龄分布亦无显著差异（p>0.01）。结论为群体结构、家系预测和年龄等主要混杂因素不太可能显著影响模型性能。
（2）模型表现（Model performances）：通过16个模型（4种算法×CpG或PC×1分或2分差距）在20次划分上的测试，AUC范围为0.548—0.693，分类准确率为0.535—0.622；敏感性为0.641—0.830，特异性均低于0.586；训练集与测试集性能差距为0.067—0.167，且测试分类准确率置信区间更宽。结论为所有模型均优于随机分类（AUC=0.5），低生育力公牛比高生育力公牛更易被识别，但模型在独立公牛群体中的预测能力存在较大变异。
（3）算法、生育力差距和数据划分影响模型性能（Algorithms, fertility gap and splittings influence model performances）：通过非参数检验发现，初始训练/测试划分对测试AUC有显著影响（p=0.0068），算法影响显著（p=2.3×10^?5），RF优于LASSO、GB和NN，而LASSO、GB、NN两两比较无显著差异（p>0.68）；生育力差距影响高度显著（p=7.48×10^?10），2分差距模型优于1分差距模型；预测变量类型无显著影响（p=0.117）。PC较CpG在训练集到测试集性能下降方面更少（p=0.009；平均准确率损失0.0975对0.13）。结论为算法、生育力差距和初始划分显著影响性能，而输入预测变量性质影响较小。
（4）模型性能与训练集大小的关系（Relationship between model performance and training set size）：通过采用CpG、2分差距、LASSO这一表现较优的操作配置进行学习曲线分析，训练集由20%增至100%时，平均AUC由0.55经0.62—0.65升至0.67；训练集超过60%后性能增益明显减缓。结论为扩大队列可能提高稳健性，但分类准确率的边际增益可能有限。
（5）CpG标志物遗传力（CpG markers heritability）：通过将LASSO CpG 2分差距模型在20次重采样中选择的CpG按选择频率分组并评估遗传力，发现各组遗传力中位数为0.19—0.26，与全部CpG的中位数0.19相近或略高；高遗传力CpG未见明显富集。结论为模型预测性能并非完全由DNA甲基化的遗传成分解释。
（6）对人工授精部门的潜在收益（Potential benefits for the artificial insemination sector）：通过敏感性和PPV评估，三个较平衡模型为LASSO CpG 2分差距（敏感性0.682、特异性0.586）、RF CpG 2分差距（敏感性0.737、特异性0.499）和RF PC 2分差距（敏感性0.719、特异性0.498），其中RF CpG 2分差距模型在两指标上优于RF PC 2分差距模型，故后者被排除。本队列低生育力比例为0.448，随机模型PPV为0.448，LASSO模型PPV为0.572，RF模型PPV为0.544，分别相当于识别低生育力个体的能力提高12.4和9.6个百分点。结论为最佳模型较随机选择能额外识别低生育力公牛，对育种选择具有潜在应用价值。
五、讨论部分总结
讨论指出，最佳模型AUC最高为0.693、分类准确率最高为0.622，与Costes et al.在Montbéliarde牛中报道的0.72准确率相对一致；本研究的准确率较低可能与变量选择未在同一数据集进行、采用20次划分及队列较大有关。与基于精子形态或核形状的小样本研究（n≤17）相比，本研究队列更大，结果更稳健和可推广。尽管性能中等，但商业公牛生育力变异范围较窄，2分差距模型表现更好；AUC整合所有阈值而分类准确率采用固定0.5阈值，优化阈值可能改善实际应用。RUMIGEN EpiChip可用于常规DNA甲基化测量，仅使用其中约三分之一标记即可获得有希望结果；扩大该工具使用可增加队列规模并改进模型。最佳模型较随机分类多识别12.4个百分点低生育力公牛，考虑到公牛AI使用规模很大，可能具有显著经济收益，但本研究未直接量化。与直接预测生育力指数的遗传模型R²难以直接比较；本研究强调独立队列和迭代测试的必要性，训练集与测试集性能差距及初始划分效应说明严格评估的重要性。RF整体表现较好可能与其抗过拟合机制有关，但GB和NN的超参数范围有限。PC性能不差且可降低计算资源需求；低生育力公牛更易识别可能提示其存在特定表观遗传特征，但机制未探索。所选CpG遗传力与全集中位数接近、亲缘系数无组内富集，提示模型可能捕获多因素表观遗传特征而非混杂家系结构或纯加性遗传效应；Holstein田间生育力遗传力通常h²<0.05，限制基因组选择的单独预测能力，凸显精子表观遗传标志物的互补价值。未来可构建同队列基因组预测基线并联合遗传与表观遗传标志物。局限包括队列规模仍有限、生育力类别定义具有相对性和任意性、未来可预测连续NRR₅₆、模型为Holstein特异、仅覆盖部分甲基化组、未深入探索具体甲基化特征及生物学机制。
六、研究结论翻译
本研究评估了四种机器学习算法在351头个体队列中利用部分DNA甲基化组数据区分生育力良好与低生育力公牛的能力。模型达到AUC 0.693和分类准确率0.622，优于随机期望。这些结果强化了牛甲基化组的预测潜力，尽管其仍不足以完全预测复杂的生育力表型。从应用角度看，表现最佳模型比随机分类多识别12.4个百分点的低生育力公牛；这一改善可能在大型育种计划中转化为显著经济收益。从方法学角度看，本研究强调严格评估程序的必要性，包括足够大且独立的队列，以及选择适合预测任务生物学背景的机器学习算法。