《The Journal of Basic and Applied Zoology》：Comparative insights into molecular detection and IS1311-based genotyping of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in cattle from Indian Gaushalas
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背景：副结核（约内氏病）是由副结核分枝杆菌（MAP）引起的一种慢性家畜传染病，造成重大经济损失。靶向IS900、ISMav02和F57基因的分子检测方法被广泛用于检测，但分析灵敏度和特异性的差异会影响诊断一致性和流行率估计。方法：采用分子PCR检测和培养对21
背景：副结核（约内氏病）是由副结核分枝杆菌（MAP）引起的一种慢性家畜传染病，造成重大经济损失。靶向IS900、ISMav02和F57基因的分子检测方法被广泛用于检测，但分析灵敏度和特异性的差异会影响诊断一致性和流行率估计。方法：采用分子PCR检测和培养对213份家畜粪便DNA样本进行分析。数据以配对方式比较诊断一致性。MAP阳性样本分别进行IS1311 PCR-REA和IS1311 locus-2 PCR-REA进行基因分型和亚基因分型。采用Cohen's kappa和Fisher精确检验检查检测方法间的一致性。结果：传统IS900 PCR与ISMav02 PCR比较显示54例真阳性（TP，25.4%）和157例真阴性（TN，73.7%），2例假阳性（FP，0.9%），无假阴性（FN）。传统IS900 PCR与F57 PCR比较，记录到56例TP（26.3%）和152例TN（71.4%），无FP，5例FN（2.3%）。与F57 PCR相比，ISMav02 PCR显示54例TP（25.3%）和152例TN（71.4%），无FP，7例FN（3.2%）。最高表观流行率值由F57 PCR获得（28.6%），其次为传统IS900 PCR（26.3%）和ISMav02 PCR（25.4%）。IS1311 PCR-REA显示真正MAP阳性牛中最常见的基因型为"印度Bison型"。结论：三种分子检测方法高度一致，F57 PCR检出更高的MAP流行率，表明其分析灵敏度更高。IS900和ISMav02检测中出现假阴性表明单独使用这些检测方法可能导致对真实流行率的低估。F57与基于IS900和ISMav02基因的PCR联合使用可提高诊断准确性并促进家畜副结核监测。
副结核（Johne's disease，JD）是一种由副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis，MAP）引起的慢性进行性肠道疾病，给畜牧业造成重大经济损失，且因其与人类克罗恩病（Crohn's disease）的潜在关联而受到公共卫生关注。靶向IS900、ISMav02和F57基因的PCR检测是MAP诊断的主要手段，但不同分子检测方法在靶DNA拷贝数、分析灵敏度和抗粪便抑制剂能力等方面存在差异，可能导致流行率估计偏差。MAP分离株可分为Cattle型、Sheep型和Bison型三种基因型，其中印度Bison型菌株在IS1311插入元件 locus 2 第64-65位存在两个碱基对（TG）缺失，可作为独特的分子标志。该研究旨在利用IS1311 PCR-REA和IS1311 locus-2 PCR-REA直接从粪便DNA中对印度家畜MAP分离株进行基因分型和亚基因分型，并比较三种分子检测方法（传统IS900 PCR、ISMav02 PCR和F57 PCR）的诊断性能。研究采集了Mathura地区Gaushalas中体况评分（BCS）<3、体重减轻、进行性消瘦和持续性腹泻的弱牛粪便样本213份，提取DNA后分别进行三种PCR检测，阳性样本进一步进行IS1311 PCR-REA基因分型和IS1311 locus-2 PCR-REA亚基因分型，采用Cohen's kappa和Fisher精确检验分析检测方法间的一致性。结果表明，三种分子检测方法间具有高度一致性，IS900 PCR与ISMav02 PCR之间一致性最高（κ=0.959±0.041），IS900 PCR与F57 PCR之间为κ=0.920±0.056，ISMav02 PCR与F57 PCR之间为κ=0.839±0.077，所有相关性均具有统计学意义（p<0.0001）。F57 PCR检出61例阳性（28.6%），传统IS900 PCR检出56例（26.3%），ISMav02 PCR检出54例（25.3%）。IS1311 PCR-REA显示所有IS900 PCR阳性样本均为"Bison type"基因型，IS1311 locus-2 PCR-REA经BsaJI酶切后产生67 bp、78 bp和262 bp三条特征性片段，确认印度Bison型MAP的存在。该研究的重要意义在于：F57 PCR具有更高的分析灵敏度，单独使用IS900或ISMav02检测可能导致流行率低估；F57与IS900和ISMav02基因PCR联合使用可提高诊断准确性；IS1311 locus-2 PCR-REA无需培养即可直接从粪便DNA中特异性鉴定印度Bison型MAP，为资源有限地区的分子监测提供了实用工具。研究方法方面，研究人员采集了印度Mathura地区Gaushalas中体况评分（BCS）<3的弱牛粪便样本213份（纳入标准为体重减轻、进行性消瘦和持续性腹泻），提取粪便DNA后分别进行靶向IS900、ISMav02和F57基因的PCR扩增，阳性样本进一步采用M56/M119引物进行IS1311 PCR-REA基因分型（HinfI和MseI酶切），并采用IS1311_L1/IS1311_L2引物进行IS1311 locus-2 PCR-REA亚基因分型（BsaJI酶切），最后采用Cohen's kappa和Fisher精确检验进行统计学分析。研究结果如下：（1）分子鉴定与流行率：213份粪便DNA样本中，152份（71.4%）在三种检测中均为阴性（TN），54份（25.3%）在三种检测中均为阳性（TP），5份（2.3%）为假阴性（FN）；传统IS900 PCR检出56例阳性（26.3%），ISMav02 PCR检出54例阳性（25.3%），F57 PCR检出61例阳性（28.6%）。（2）配对诊断效能分析：IS900 PCR与ISMav02 PCR比较显示54例TP、157例TN、2例FP、0例FN，相对灵敏度100%、相对特异性97.8%；IS900 PCR与F57 PCR比较显示56例TP、152例TN、0例FP、5例FN，相对灵敏度88.9%、相对特异性100%；ISMav02 PCR与F57 PCR比较显示54例TP、152例TN、0例FP、7例FN，相对灵敏度83.3%、相对特异性97.7%。（3）一致性分析：IS900 PCR与ISMav02 PCR之间κ=0.959±0.041，IS900 PCR与F57 PCR之间κ=0.920±0.056，ISMav02 PCR与F57 PCR之间κ=0.839±0.077，均具有统计学意义（p<0.0001）；回归分析显示三种检测方法间斜率1.60、截距-0.23，R2=0.999（p=0.023），表明检测效率几乎相同。（4）基因分型与亚基因分型：所有56份IS900 PCR阳性样本在IS1311_REA中均显示"Bison type"基因型模式；IS1311 locus-2 PCR-REA经BsaJI酶切后，印度Bison型MAP产生67 bp、78 bp和262 bp三条特征性片段，可与非印度型MAP基因型区分。讨论部分指出，三种分子检测方法间具有高度一致性，IS900与ISMav02 PCR间一致性最高（κ=0.959），反映了其对MAP的高特异性及与鸟分枝杆菌复合群（MAC）非MAP成员的最低交叉反应性。F57 PCR检出5例IS900 PCR未检出的阳性样本，但在缺乏独立确认和线分析灵敏度评估的情况下，不能将此差异归因于F57的更高灵敏度；本研究中流行率反映的是不同检测方法的检出率而非三种靶标灵敏度的排序。在低排菌动物中，单拷贝靶标F57 PCR可因模板量低而灵敏度下降，但本研究中镜检显示为中高排菌者（+2至+4），在此条件下DNA拷贝数不再是PCR的唯一限制因素，引物扩增效率、扩增子大小和粪便PCR抑制剂耐受性驱动诊断性能，使F57 PCR在本临床队列中显示高诊断率（28.6%表观流行率）。IS900和ISMav02 PCR相对于F57 PCR出现假阴性结果，表明在地方性流行区存在间歇性排菌、粪便PCR抑制和拷贝数差异等固有诊断问题，支持采用多种检测方法进行MAP感染充分诊断的共识。传统IS1311 PCR-REA显示Bison型基因型在MAP阳性样本中独占优势，与北印度多项分子流行病学研究结果一致。但传统IS1311 PCR-REA的分辨率不足以区分印度Bison型与全球流行的其他Bison型分离株。本研究首次在无需培养的条件下利用IS1311 locus-2 PCR-REA对粪便DNA进行印度Bison型MAP亚基因分型鉴定，通过BsaJI酶切产生67、78和262 bp三条特征性片段确认了第64-65位独特TG缺失的存在，与Singh等（2015）首次利用培养分离株描述IS1311 locus-2 PCR-REA为印度Bison型MAP特异性标志物的结果一致。尽管MLVA和全基因组测序等现代高分辨率分子分型技术具有更好的分辨力，但其成本和技术要求使其在资源有限的地方性流行区不切实际，而IS1311 locus-2 PCR-REA技术更为实用。印度Bison型MAP的一致检出表明其是印度及印度次大陆内适应的优势谱系。研究结论：IS1311 locus-2 PCR-REA是一种高效且高度特异的技术，可直接从粪便样本中鉴定印度Bison型MAP分离株；与靶向IS900、ISMav02和F57基因的分子技术联合使用，可提高诊断的总体可靠性并使检测结果与菌株信息相关联；该联合方案有助于获得MAP流行率的详细信息并确认印度Bison型菌株在动物中的流行；通过多区域研究结合培养分离、细菌载量定量和测序可进一步增强分子监测效率并制定基于证据的约内氏病预防和控制策略；检测与简易基因分型的联合可促进疾病监测和干预措施以及印度动物生产力的保护。
