《Acta Neuropathologica》：CSF cytology: core principles, diagnostic pitfalls and emerging digital tools including artificial intelligence and telecytology
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尽管神经影像学、分子诊断和数字技术不断进步，脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）细胞学仍是中枢神经系统（central nervous system, CNS）感染性、自身免疫性、出血性和肿瘤性疾病诊断评估的基石。本叙述性综述总结CSF细
尽管神经影像学、分子诊断和数字技术不断进步，脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）细胞学仍是中枢神经系统（central nervous system, CNS）感染性、自身免疫性、出血性和肿瘤性疾病诊断评估的基石。本叙述性综述总结CSF细胞学的既定原则，强调方法学局限和诊断陷阱，并整合新兴进展，包括自动化细胞计数（automated cell counting）、人工智能（artificial intelligence, AI）和远程细胞学（telecytology）。前分析因素（pre-analytical factors）是诊断准确性的关键决定因素。样本处理延迟会促进pH依赖性自溶（autolysis）和显著细胞丢失，而快速细胞离心涂片（cytocentrifugation）可保存细胞形态并促进可靠评估。自动化细胞计数仪（automated cell counters）正日益应用于常规实验室，并在技术人员有限的环境中具有优势。然而，当前系统在细胞计数低和轻度升高的样本中精度有限，且形态学评估能力有限。手工计数池计数（manual chamber counting），尤其是在正常和低细胞计数范围内，仍是CSF细胞定量评估的金标准；而专家显微镜检查仍是定性细胞形态学评估的参考标准。尽管神经影像学的敏感性不断提高，CSF细胞学在感染性和肿瘤性疾病检测以及蛛网膜下腔出血（subarachnoid haemorrhage, SAH）评估中仍具有独特诊断作用。红细胞吞噬细胞（erythrophages）、含铁血黄素吞噬细胞（siderophages）和血褐素结晶（haematoidin crystals）的细胞学检测可发现出血并提供其时间阶段线索。总体而言，当与临床、实验室、微生物学、免疫学和影像学发现整合时，CSF细胞学仍是重要诊断工具。仔细识别常见陷阱至关重要。研究人员建议快速处理CSF、常规制备细胞离心涂片（cytospin）染色玻片并由专家进行显微镜复核，并且仅在明确验证的工作流程（validated workflows）内实施自动化或数字化方法。
**引言：CSF差异细胞分析基础**
CSF主要由侧脑室脉络丛产生，循环于脑室系统、蛛网膜下腔和脊髓中央管，兼具机械缓冲和信号分子、代谢物及蛋白运输功能。每日生成约500 mL，总量150–170 mL，约5–7小时更新。诊断性CSF通常经L3/4或L4/5腰椎穿刺获取，枕下或侧颈穿刺已少用，特定情形可经外引流获取脑室CSF。生理性CSF清亮、无色、近乎无细胞。充分采样体积对诊断准确性重要；除计数和显微镜外，标准分析应包括蛋白、葡萄糖、乳酸及白蛋白和免疫球蛋白商，并可结合CSF/血清商图解释。至少一张染色玻片的细胞学评估至关重要。
**文献检索与综述方法**
本文为叙述性、专家驱动综述，非系统综述。文献通过迭代性主题数据库检索、参考文献追踪及教材、专著和细胞学图谱补充获得。未预设固定出版期或检索式，兼顾历史与当代文献，按与综述范围和当前诊断实践的相关性选择。不同文献间差异予以保留和讨论，而非进行正式证据加权。更新检索针对手工与自动化CSF细胞定量，最终纳入15项研究。
**CSF细胞学—历史与基础**
Quincke报告了早期经皮腰椎穿刺并研究CSF压力、化学成分、细胞学及病理发现。CSF诊断早期多在德语国家发展，包括Fuchs-Rosenthal计数池和Pappenheim染色。早期细胞产量少且形态常破坏。Sayk引入沉降室后，CSF细胞分析可靠性提高；细胞离心技术使CSF细胞学更可行。CSF细胞基本形态和染色特征长期稳定，历史争议主要在细胞群解释和分类，如淋巴细胞亚型、巨噬细胞活化状态及反应性与肿瘤性细胞鉴别。肿瘤命名和分子分类演变要求谨慎解读旧文献。现有图谱和教材可用于实践学习，并采用当前WHO肿瘤分类命名。
**前分析与方法学考虑**
首次检查至少采集5 mL，最好10–15 mL；单纯细胞学至少2–3 mL；怀疑恶性肿瘤时增大体积可提高敏感性，采集至30 mL通常安全，腰穿后头痛主要与针特性相关。样本应使用无菌聚丙烯管；玻璃管可致细胞黏附而低估计数，常规EDTA或氟化钠管不适合细胞学。序贯多管采集有助于评估创伤性腰穿血污染并分送常规和特殊分析。处理时间关键：采样后CSF pH由约7.3升至碱性，数小时内促进自溶，高温加速；应在1–2小时内处理。淋巴细胞在5小时内可减少约10–53%，24小时内可达60%；血污染样本72小时后40–78%细胞溶解。中性粒细胞和肿瘤细胞更脆弱。延迟时至少2小时内完成自动或手工计数，并尽快制片。
**自动化与手工细胞计数**
Fuchs-Rosenthal计数池常用于手工计数，使用采集后2小时内的新鲜天然CSF，总量3.2 μL，滴入前轻柔混匀并静置沉降。未染色标本可计数红细胞和核细胞，但不能可靠区分白细胞与其他核细胞，可能报告假性升高。细胞丰富或血污染样本可用0.9% NaCl按1:10稀释，并换算为个/μL。自动化血液分析仪提高周转和标准化，在高细胞及重度出血神经外科样本中表现较好；但CSF白细胞可靠定量下限约20个/μL（设备依赖），旧系统约50个/μL，低于30个/μL需手工计数确认。系统综述提示低值范围数据有限，<20个/μL相关性较弱；更新研究总体一致性尚可，但低值仍设备依赖，5个/μL决策阈值附近存在临床差异。自动分类仅作筛查，不能可靠识别浆细胞、活化淋巴细胞、原始细胞、含铁血黄素吞噬细胞、散在肿瘤细胞或细胞簇。手工计数仍是定量金标准；自动化可作一线但低和轻度升高计数需确认。白细胞定量不应以高倍视野估计替代，细胞离心涂片回收受技术、离心条件、体积和沉积面积影响，高倍视野阈值不标准化。正常成人腰椎CSF参考范围系历史描述性系列和实验室参考范围整合形成。
**CSF细胞计数中的血液校正**
血液混入是CSF解释常见挑战，可影响细胞学和生化参数。粗略估算每1000个红细胞引入约1个白细胞；强血混入（>100,000个红细胞/μL）时线性回归校正公式不准确，倾向高估加入白细胞而低估真实白细胞。白血病、活动性系统性感染、贫血或白细胞减少时比例可显著偏移，应考虑患者实际血红细胞/白细胞比。为减少血污染，细胞计数应使用最后一管，并观察序贯管血液清除情况。
**细胞分化**
CSF近乎无细胞，需将细胞浓缩至玻片。细胞离心涂片是当前标准，风干后行Pappenheim（May-Grünwald-Giemsa）染色；Gram、Prussian blue、India Ink、Ziehl–Neelsen等用于特定检查但较少用。专家显微镜检查染色细胞离心涂片仍是定性细胞分化参考标准，可识别反应性淋巴细胞、浆细胞、活化巨噬细胞、粒细胞、非典型和恶性细胞、核分裂及细菌，并区分真性细胞增多与假性升高。
**正常CSF细胞学**
生理性CSF细胞几乎均为免疫细胞，不来源于神经组织；血-CSF和血-脑屏障阻止红细胞和粒细胞被动通过，仅允许淋巴细胞和单核细胞有限迁移。正常成人CSF≤4个/μL，以淋巴细胞和单核细胞约70:30为主。手工分类常基于100个随机细胞，百分比为点估计并受二项变异影响，如30%的约95%置信区间为21–40%。Pappenheim染色下核呈紫罗兰色嗜碱，胞质淡至灰蓝；淋巴细胞小（约7–9 μm），单核细胞约15–20 μm。活化淋巴细胞判断需谨慎，轻微大小或胞质变化可见于非病理样本，过早判为“活化”是常见过度解释。
**伪影**
伪影包括穿刺引入的细胞或颗粒，以及制备和染色过程中新增或出现的变化。红细胞除非穿刺引入或出血，否则不应存在；人工血污染可达70%。穿刺可带入皮肤、肌肉、软骨、骨髓和上皮细胞；内皮细胞呈大多边形细胞簇，软骨细胞位于嗜碱软骨基质，室管膜或脉络丛细胞呈立方细胞片或蜂窝状簇，不应误为癌。骨骼肌、平滑肌和骨髓三系混合可见，骨髓污染伴红细胞。污染可假性升高计数，应记录并由细胞学确认。人工细菌污染可模拟感染，细菌位于细胞间“空隙”且无细胞增多或中性粒细胞时需警惕。自溶数小时内开始，先累及粒细胞，肿瘤细胞可能更快；核溶解、核碎裂、核模糊、颗粒丢失、空泡和影子细胞可降低计数并模糊鉴别，应标注。染色伪影包括深紫颗粒模拟细菌、试剂陈旧或冲洗不足、磷酸缓冲液pH约6.8漂移致染色不佳；细胞丰富涂片需稀释，否则多层染色不均；细胞离心高离心力可扭曲核和细胞形态。
**炎症性CNS疾病的细胞学模式**
炎症表现为差异计数偏移和免疫细胞活化，但模式非疾病特异，不能单独确定病因，受疾病期、治疗、血污染和采样部位影响。反应性淋巴细胞约10–20 μm，染色质开放、胞质较丰富、核轮廓可变；核凹陷、不规则和核仁可为反应性，不应视为恶性，但明显胞质不规则和深核切迹在肿瘤性淋巴细胞更常见。多数活化淋巴细胞为T细胞；神经疏螺旋体病可见淋巴细胞核分裂。浆细胞为终末分化B细胞，核偏心扁平、染色质粗、核周淡区（Golgi）、胞质深嗜碱，可先于鞘内免疫球蛋白合成检测。单核细胞活化为巨噬细胞后增大、空泡化，可见泡沫细胞或印戒样细胞。中性粒细胞急性期可见带状核，炎症时超分叶至4–6段；散在中性粒细胞可见于无细胞增多的“正常”CSF，与感染关联证据少。嗜酸性粒细胞增多罕见，提示寄生虫或球孢子菌感染、肿瘤性脑膜炎（尤其霍奇金病）、分流反应、AQP4-IgG阳性NMOSD、血管炎或药物性无菌性脑膜炎。嗜碱性粒细胞罕见，诊断意义不明，应结合血污染、血液或软脑膜肿瘤、结节病或病毒性脑膜炎解释。
**感染性CNS炎症**
细菌性化脓性脑膜炎为急症，经典表现为高细胞计数（常>数千个/μL）和中性粒细胞为主，成人常>90%。感染呈阶段性：早期约12小时内细菌可直接检出而炎症轻，细胞可正常或近正常，甚至无中性粒细胞浸润，即“无脓性”脑膜炎，老年和免疫抑制者更常见。进展后中性粒细胞减少，巨噬细胞、活化单核和淋巴细胞相对增加；抗生素前腰穿可数小时内灭菌，但最初数小时白细胞变化不大。免疫抑制者可低细胞增多或正常，正常白细胞不排除感染。神经疏螺旋体病通常50–500个/μL，早期和治疗前可有中性粒细胞，强淋巴细胞活化、浆细胞增多和核分裂可似肿瘤性脑膜炎，但淋巴瘤通常缺乏轻度至中度活化淋巴细胞；疑难时需流式、整合CSF报告、CXCL-13、Borrelia抗体指数和血清学。病毒性CNS感染通常淋巴性细胞增多50–500个/μL，但肠道病毒、西尼罗、FSME、HSV可暂时无细胞增多或中性粒偏斜；机会性感染如Human polyomavirus 2（原JCV）、CMV细胞学可不明显。结核性脑膜炎约50–1000个/μL，混合细胞，早期中性粒，进展或治疗后淋巴为主，偶见嗜酸；Ziehl–Neelsen仅少数阳性，核酸扩增为金标准，7–10 mL大体积可提高敏感性。真菌性CNS感染细胞学高度异质，依赖病原、阶段和免疫状态，病原浓度低，需足够样本体积。
**自身免疫性炎症**
非感染性自身免疫病CSF细胞学通常为低至中度淋巴单核细胞增多，某些实体有特征，解释需结合临床和进一步检测；细胞学支持但不能单独确立诊断。多发性硬化常规CSF常正常或轻度淋巴单核细胞增多，通常<50个/μL；复发时轻度细胞增多和淋巴细胞活化包括免疫球蛋白产生浆细胞更常见，但细胞计数与临床活动相关性有争议。其他自身免疫病可形态学模拟感染，需综合检测和随访。AQP4-IgG阳性NMOSD和MOG抗体相关疾病（MOGAD）发作期细胞增多更明显，可达500个/μL，常见中性粒细胞和偶见嗜酸性粒细胞，尤其NMOSD和儿童；与MS不符时应怀疑，初期可模拟细菌感染。自身免疫性脑炎不一定有细胞增多，老年亚型常正常；若存在多为轻中度淋巴性，某些急性期可见中性粒细胞并模拟感染。
**其他CSF炎症原因**
鞘内治疗可致特征性变化。Nusinersen治疗脊髓性肌萎缩症时，巨噬细胞出现多个清晰紫/蓝包涵体（“nusinophages”），无明显持续炎症偏移；Tofersen治疗SOD1突变ALS亦可出现类似巨噬细胞包涵体，并常伴CSF白细胞、鞘内免疫球蛋白合成和蛋白升高，偶有无菌/化学性脑膜炎或脊髓炎，常无症状但需识别为治疗相关。鞘内激素和其他药物可致无菌性中性粒细胞增多（化学性脑膜炎）。静脉注射免疫球蛋白（IVIG）可致无菌性脑膜炎，输注后数小时至数天出现明显细胞增多，早期常中性粒为主，蛋白高而微生物阴性。短间隔重复腰穿可致轻度反应性细胞增多。无感染、自身免疫病或近期腰穿时，CNS组织损伤如术后、外伤或缺血性卒中可致轻度反应性炎症。
**CNS出血**
头颅CT在部分SAH尤其亚急性者中可无异常；CSF颜色、离心后上清黄色变、铁蛋白和靶向细胞病理分析可提供证据，但黄色变或红细胞显著升高不特异。出血后巨噬细胞吞噬血液成分：红细胞吞噬细胞通常在4–12小时内出现，数天内逐渐演变为含铁血黄素吞噬细胞，后者通常24–48小时后出现，含深色颗粒且普鲁士蓝阳性；中间型混合细胞不应视为独立明确时间窗。序贯样本同时见新鲜红细胞吞噬和晚期含铁血黄素提示再出血。降解后空泡可模拟泡沫巨噬细胞，但非特异；保存红细胞、含铁血黄素或血褐素更特异，普鲁士蓝可确认。更晚期可见黄橙色菱形或星状血褐素（胆红素）结晶，可在巨噬细胞凋亡后漂浮数月，偏振光下可见。形态学分类可推断出血时间或急缓；序贯再出现红细胞吞噬细胞提示重复或持续出血，应结合临床和影像。鞘内治疗时异物巨噬细胞呈泡沫空泡和嗜碱包涵体，不应误为含铁血黄素吞噬细胞。长时间运输无证据表明人工血污染可在体外产生红细胞吞噬细胞。
**CSF细胞学中的肿瘤性疾病**
常规CSF细胞学仍是怀疑软脑膜受累或肿瘤性CNS过程时常规检查的关键；正常白细胞计数不排除CNS肿瘤，高验前概率时指南建议细胞学并必要时重复。恶性细胞回收依赖组织学亚型、CSF空间接触、疾病负荷和前分析因素。脑实质肿块如脑膜瘤在软脑膜或室管膜边界完整时通常细胞学阴性，除非间变或软脑膜/脑室内播散。恶性细胞形态标准包括异常大小和形状（单个肿瘤细胞常20–25 μm，可至200 μm）、核增大或多形、不规则、核仁或假包涵体、核镶嵌、多核、染色质改变、非典型核分裂或凋亡、异常胞质如腺癌空泡、伪足、高核质比和深嗜碱、可能簇集、吞噬肿瘤细胞及伴随炎症反应。无单一特征病理特异性，标准越多越可靠；前分析恶化可产生假核仁，自溶标本应谨慎并尽快重复。黑色素瘤色素应与含铁血黄素区分。不确定时可称“非典型”细胞和“疑似肿瘤性脑膜炎”，建议重复穿刺并取大体积。阳性时形态很少确定肿瘤分类，需免疫细胞化学、流式或活检；血液肿瘤流式可提高敏感性但阳性标准未完全标准化，细胞块可助免疫和分子分析。软脑膜转移中循环肿瘤细胞检测和CSF液体活检（循环肿瘤细胞及cfDNA/ctDNA靶向测序、NGS、数字PCR、纳米孔测序、甲基化分析）可提高敏感性和分子信息，目前为补充而非替代常规细胞学。日常应取大体积、快速处理，首次阴性但怀疑持续时重复腰穿；首次敏感性约50–60%，重复可达约80%。
**婴幼儿和儿童CSF细胞学：年龄相关白细胞计数和差异模式**
年龄依赖参考范围：新生儿CSF白细胞上限较低但略高于年长儿；318名婴儿中早产儿第95百分位为12个/μL，足月儿14个/μL，生后3个月内接近≤4个/μL。产程头部压迫未证实；血-CSF屏障或CSF循环未成熟假说存在但缺乏可靠研究。健康新生儿以单核细胞（淋巴细胞和单核细胞）为主，但可有少量中性粒细胞，早产儿更常见；约2月龄后比例同成人。早期生命诊断陷阱包括：无脓性脑膜炎在新生儿和婴儿更常见，40例<90天婴儿44次培养或PCR证实细菌性脑膜炎中13次（30%）CSF白细胞正常，较大新生儿培养证实者6.5%（12/184）无显著升高，而成人约2%；血污染和校正公式方面，新生儿创伤性穿刺常见，固定1000:1红细胞:白细胞校正可误分类并掩盖细菌性脑膜炎细胞增多，≤60天婴儿用1000:1会重新分类部分病例为“无细胞增多”，队列提示1:400或1:877更准，儿科一般建议报告未校正白细胞和红细胞污染程度并临床解释，而非“校正掉”。
**CSF细胞学的地形学：解读脑室CSF**
脑室CSF差异计数：脑室CSF通常经外引流在出血、神经外科、外伤或脑积水后获取，组织颗粒和室管膜炎需仔细显微镜检查。细胞和颗粒在CSF空间分布不均，脑室样本可能低估炎症，正常脑室白细胞不等于远端正常；同一患者腰椎白细胞通常高于脑室，反映分区、头尾梯度和沉降；脑膜炎比较中腰椎白细胞高于脑室，但无共识规定脑室正常范围。从细胞学家角度诊断室管膜炎：尽管常预期细胞增多，但相当部分患者无白细胞升高；meta分析显示细菌性室管膜炎93%有白细胞升高，而无室管膜炎者32%升高；医疗相关室管膜炎正常白细胞、糖或蛋白不能可靠排除，尤其抗生素后、低负荷或分区病变，指南优先CSF培养和重复检测。脑室CSF细胞增多常中性粒为主，但可被手术、脑室内出血或鞘内治疗钝化，且红细胞升高混淆解释。血液污染校正：固定1:666或1:1000校正过/低估比例高，有些建议脑室CSF报告未校正白细胞；患者特异校正指数CI=（CSF白细胞÷CSF红细胞）/（血白细胞÷血红细胞），CI较血比升高≥4–5倍与室管膜炎相关，2024年多中心分析支持CI为辅助但切点不同且不替代培养；序贯分析可及时发现白细胞和CI突增。装置相关嗜酸性粒细胞增多见于分流或引流患者，与硬件故障、CSF渗漏和有时感染（如Cutibacterium acnes）相关，应评估机械问题和靶向微生物；中性粒丰富但培养阴性可反映术后化学性脑膜炎或脑室内药物刺激，需结合手术过程和治疗。总体脑室CSF更易受血污染和装置异物反应混淆，也更易因空间梯度呈“假温和”，解释应明确部位标签、趋势分析并整合临床、微生物和影像。
**保持更新：数字化和人工智能（AI）时代CSF细胞病理学新兴工具**
液体活检和高维免疫表型快速发展，但CSF细胞病理学也有重要进展，并将作为新技术基础和补充。AI在CSF和体液细胞病理学中，近五年深度学习（DL）从概念验证进入小型临床可行性研究；CSF卷积模型在数字化细胞离心涂片上可进行五分类白细胞和肿瘤细胞鉴别，甚至按推测原发部位区分癌亚型。2022年五分类模型在90例软脑膜转移患者>50k单细胞裁剪中显示稳健癌细胞检测和癌亚型分类，其他团队展示可解释DL分类诊断相关CSF细胞类型并提供全片病例标签。早期神经网络也用于细胞计数和粗谱系门控预筛，以优先呈现视野供人工评估，在低细胞CSF中较有前景。但研究多为单中心、数据集 curated、外部验证有限，跨实验室、染色和扫描仪的泛化未保证；其他体液如胸腔积液证据更强。综述认为AI可辅助但不能替代专家，需要多中心验证和工作流整合。监管AI分诊已有先例，FDA已清除用于Pap涂片AI预筛的平台；影像流式联合AI用于恶性细胞富集亦有探索。CSF实验室近期用途可能包括AI辅助预筛排序可疑肿瘤或非典型区域、质控支持（标记异常染色、聚焦或不合理差异）以及疑难病例决策支持，但始终需细胞病理学家监督；下一步需前瞻、多中心、 vendor-agnostic扫描仪、标准化染色、外部测试集，并报告校准、类别不平衡和人因结局。远程细胞学方面，远程医学和病理可保持广泛及时专家输入并减少转运和周转延迟；数字病理指南支持细胞学验证，包括最低病例数、与玻璃片一致性和持续质控。远程细胞学可通过远程控制实时显微镜或全片成像（WSI）存储转发会诊。CSF细胞离心涂片常规全片数字化在低细胞标本中技术挑战较大，自动细胞检测和自动对焦可能失败；可手动定义细胞沉积区、增加焦点、多平面/Z-stack扫描或扩展景深，改善不同焦平面细胞显示，但扫描时间更长、文件更大，且这些策略多来自一般细胞学，尚未在CSF细胞离心涂片系统验证。前瞻性细胞学研究显示训练有素和基础设施稳定时， adequacy判断和初步诊断高度一致。CSF远程细胞学潜力在于经济压力和服务整合下集中专家、服务外周无本地专家机构；建立区域远程网络需中心与外围合作并统一标准，如送标准化固定染色细胞离心玻片或现场显微镜远程会诊；分散设施的前分析、制片和染色质量更难维持，且缺乏本地质量反馈。
**总结**
CSF细胞学仍是CSF分析的有力工具，细胞学发现需与临床数据和蛋白等结果整合为综合报告；专家显微镜评估仍是定性CSF细胞学参考标准。计算机辅助技术正快速发展并具潜力，其实施应伴随批判性评估和验证，以确保诊断准确性，并适应未来十年CSF诊断技术和组织变化。
