《Advances in Gerontology》：Subcellular Therapy: Targeting Mitochondrial DNA Mutations. Clinical Case Report
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线粒体功能障碍是公认的动脉粥样硬化发病机制促进因素。多项研究提示5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）可能特异性靶向功能障碍的线粒体。本研究旨在验证5-ALA可促进细胞内功能障碍线粒体的选择性清除、从而恢复携带动脉粥样硬化相关线粒体突变的胞质杂种（cybrid）细胞系
线粒体功能障碍是公认的动脉粥样硬化发病机制促进因素。多项研究提示5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）可能特异性靶向功能障碍的线粒体。本研究旨在验证5-ALA可促进细胞内功能障碍线粒体的选择性清除、从而恢复携带动脉粥样硬化相关线粒体突变的胞质杂种（cybrid）细胞系线粒体功能的假说。胞质杂种细胞系通过将（rho0）THP-1线性细胞（一种无线粒体的人单核细胞白血病细胞系）与携带动脉粥样硬化患者血液中促动脉粥样硬化突变线粒体的血小板融合而建立。采用共聚焦显微镜对胞质杂种细胞系进行研究。通过流式细胞术使用四甲基罗丹明（TMRM）——一种可渗透细胞膜并在膜电位完整的活跃线粒体中蓄积的染料——评估荧光。开展了一项涉及人类志愿者的初步临床试验研究，以验证长期给药后5-ALA对线粒体的影响。研究发现，用5-ALA处理培养细胞可导致线粒体去极化和数量减少，推测系由线粒体自噬（mitophagy）刺激所致。该效应在携带动脉粥样硬化相关突变线粒体的胞质杂种细胞系中观察到。体外实验在体内得到验证。长期5-ALA处理导致携带特定突变的线粒体被消除，这在志愿者的循环单核细胞中观察到。对一名人类志愿者给予5-ALA 7个月，导致与动脉粥样硬化相关的若干线粒体突变的异质性（heteroplasmy）程度发生改变。本研究结果表明，代谢紊乱所致线粒体内物质蓄积，可能通过这些化合物在线粒体内过度蓄积而驱动受损线粒体的消除。
动脉粥样硬化是累及大中型动脉壁的慢性炎症性疾病，以脂质蓄积、纤维元素沉积和钙化为特征，最终导致心血管并发症，是全球主要死亡原因。尽管预防和治疗取得一定进展，仍需寻找新型分子靶标以开发安全有效的抗动脉粥样硬化疗法。越来越多的证据表明，动脉粥样硬化相关线粒体DNA（mtDNA）突变在动脉粥样硬化形成中发挥重要作用，促进动脉壁局部炎症的慢性化。在人主动脉粥样硬化病变及多种循环细胞中均已发现多种动脉粥样硬化相关mtDNA突变。因此，清除携带动脉粥样硬化相关突变的线粒体可能成为亚细胞水平抗动脉粥样硬化治疗的全新策略。在此背景下，5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）可作为选择性清除促动脉粥样硬化突变的潜在药物。5-ALA是血红素合成途径中的天然氨基酸，外源性5-ALA可导致原卟啉IX（PpIX）过量形成，后者不能被亚铁螯合酶有效加工而在细胞中蓄积。PpIX蓄积直接取决于细胞代谢活性。基于既往实验，研究人员假设代谢紊乱所致线粒体内物质蓄积将导致线粒体内过载和功能障碍线粒体的破坏。
研究人员开展了以下研究：通过将无线粒体的rho0 THP-1细胞与动脉粥样硬化患者血小板来源的线粒体融合，建立携带促动脉粥样硬化mtDNA突变的胞质杂种细胞系（TC-HSM和TC-LSM），并以共聚焦显微镜和流式细胞术评估5-ALA对线粒体膜电位和线粒体数量的影响；进一步开展了一项单志愿者初步临床研究，给予一名71岁男性志愿者口服5-ALA 600 mg/日持续7个月，评估循环单核细胞线粒体膜电位及mtDNA异质性变化。研究结论为：5-ALA处理导致胞质杂种细胞线粒体去极化和数量减少，推测通过刺激线粒体自噬实现；该效应见于携带动脉粥样硬化相关突变的线粒体，而原始THP-1细胞未受影响；长期5-ALA服用导致志愿者循环单核细胞中低膜电位单核细胞比例下降及至少4种动脉粥样硬化相关mtDNA突变（C5178A、G13513A、576insC、10958insC）异质性程度改变。研究意义在于：提出了通过药物选择性清除携带致病突变的线粒体这一亚细胞治疗新概念，为动脉粥样硬化及相关心血管疾病的靶向治疗提供了新思路。
主要关键技术方法：（1）采用King和Attardi技术经溴化乙锭处理建立无线粒体rho0 THP-1细胞系，经PEG融合法与大动脉粥样硬化患者外周血分离的血小板融合建立胞质杂种细胞系，并以长程PCR、实时PCR（SYBR Green I）和共聚焦显微镜（TMRM/Calcein）三种方式验证线粒体转移效率；（2）以JC1染料经流式细胞术测定线粒体膜电位并计算线粒体能量化指数（MEI），以TMRM和PpIX自发荧光经共聚焦显微镜评估线粒体质量与共定位；（3）采用MitoTracker Green FM和LysoTracker Red DND-99经共聚焦显微镜评估线粒体-溶酶体共定位以反映线粒体自噬；（4）以实时PCR（SYBR Green I）结合dCt法测定mtDNA异质性比例；（5）样本来源：胞质杂种细胞线粒体供者为动脉粥样硬化患者血小板，临床研究志愿者为一名71岁男性，外周血单核细胞经Ficoll密度梯度离心及CD14免疫磁珠分选获得。
研究结果：（1）体外细胞培养实验——5-ALA处理TC-LSM胞质杂种细胞4周后线粒体膜电位（TMRM/PP信号）显著下降，提示线粒体损伤；对照组THP-1细胞PpIX自发荧光面积为8.9%，5-ALA孵育后为2.2%，且观察到自发荧光灶碎片化；5-ALA预孵育细胞中PpIX与极化线粒体共定位显著低于未处理细胞（p=0.02），TMRM平均强度与共定位比例间Spearman相关系数在TC-LSM为0.729、5-ALA处理的TC-LSM为0.833（p=0.0001）；5-ALA加入后TC-LSM细胞TMRM染料活性下降2.8倍，提示细胞去极化，表明5-ALA可导致线粒体数量显著减少及每个线粒体PpIX量显著增加，推测通过刺激线粒体自噬促进线粒体消除。（2）两种胞质杂种细胞系膜电位变化——高异质性TC-HSM细胞系线粒体能量化指数显著低于低异质性TC-LSM细胞系；两系孵育5-ALA 2周后线粒体能量化指数均下降，提示mtDNA突变负荷增加及5-ALA作用均可导致显著线粒体功能障碍；5-ALA不影响原始THP-1细胞膜电位。（3）初步研究（病例报告）——志愿者每日口服5-ALA 600 mg持续7个月，低膜电位（MitoTracker-low）单核细胞比例从28.8%下降4.6倍至6.3%，平均膜电位从616相对单位升至641相对单位；对17种异质性mtDNA变异行实时PCR分析，7个月后至少4种突变（C5178A、G13513A、576insC、10958insC）异质性程度发生改变，从G13513A突变的下降趋势到其余三种突变的明显变化；其中异质性升高的10958insC突变既往被发现与动脉粥样硬化呈负相关。表明长期服用5-ALA后部分动脉粥样硬化相关突变异质性水平改变，提示携带此类突变的线粒体优先从细胞中清除。研究局限性：体内实验仅一名志愿者参与，未设计验证5-ALA的治疗有效性，而是探索特定药物能否选择性影响动脉粥样硬化相关mtDNA突变比例，单例限制无法进行完整统计评估，但为后续研究提供了依据。
讨论部分总结：本研究证明5-ALA对携带动脉粥样硬化相关线粒体突变的杂交细胞系线粒体功能的影响，与既往报道一致。5-ALA是经血红素生物合成途径刺激PpIX生成的天然氨基酸，外源性5-ALA导致PpIX过量产生，不能被亚铁螯合酶快速转化为终产物而在细胞中蓄积，因此PpIX的细胞蓄积取决于线粒体代谢活性。既往研究表明5-ALA可缓解线粒体代谢异常、抑制线粒体复合物I缺陷引起的有害表型，并可阻止mtDNA拷贝数减少和线粒体形态异常、增强线粒体抗氧化转录活性、抑制炎症基因表达、刺激巨噬细胞抗炎极化；5-ALA的抗凋亡和抗氧化特性在多种细胞模型中得到证实，但也有一项转录组研究提示5-ALA处理对HepG2细胞具有潜在毒性。本研究志愿者长期服用5-ALA导致其单核细胞线粒体池中携带特定突变的线粒体被清除，通过评估循环单核细胞mtDNA突变异质性水平予以确认；既往研究已鉴定异质性水平与动脉粥样硬化正相关或负相关的mtDNA突变，有作者提出mtDNA突变异质性阈值水平可作为评估动脉粥样硬化斑块发生发展易感性的新标志物。5-ALA的治疗应用包括作为光敏剂用于癌症成像引导光动力治疗的光诊疗学。目前基于诊疗一体化的亚细胞治疗主要应用于癌细胞，线粒体靶向治疗主要使用抗氧化剂但特异性不高，使用线粒体自噬增强剂可能是更有前景的策略，本研究显示5-ALA具备这一可能，且在线粒体靶向治疗中5-ALA还可作为锚定物、触发物或增强剂。未来研究应评估5-ALA用于治疗线粒体功能障碍相关人类疾病（如动脉粥样硬化）的可能性，并测试更广泛的线粒体突变谱。
研究结论翻译：采用胞质杂种细胞系的体外实验结果和初步研究结果支持以下假说：代谢紊乱所致物质在线粒体内蓄积可能促进功能障碍线粒体的消除。具体而言，5-ALA效应可能归因于携带动脉粥样硬化相关突变的线粒体。本研究结果鼓励进一步研究，特别是未来研究应检验5-ALA及其他能够消除携带突变线粒体的物质的作用及其用于治疗线粒体功能障碍相关人类疾病（包括动脉粥样硬化）的可能性。在此方面，应测试更广泛的线粒体突变谱。
