《Archives of Toxicology》：Combined exposure to triphenyl phosphate and haloperidol alters hepatic lipid homeostasis and xenobiotic metabolism beyond single-compound effects
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化学物质对肝脏脂质代谢（hepatic lipid metabolism）的破坏可导致脂肪变性（steatosis）或磷脂蓄积症（phospholipidosis）。毒理学风险评估主要关注单一化合物而非混合物的效应，这并不能很好地反映真实生活暴露场景。对于不具
化学物质对肝脏脂质代谢（hepatic lipid metabolism）的破坏可导致脂肪变性（steatosis）或磷脂蓄积症（phospholipidosis）。毒理学风险评估主要关注单一化合物而非混合物的效应，这并不能很好地反映真实生活暴露场景。对于不具有相似作用模式（mode of action, MoA）的化合物，其混合效应日益受到关注，多项研究已表明毒效动力学（toxicodynamic）和毒物代谢动力学（toxicokinetic）相互作用可导致意外的混合效应。本研究旨在探究一种磷脂蓄积症诱导剂与一种脂肪变性诱导剂的混合物相较于单一化合物处理如何影响肝脏脂质和异生物代谢（xenobiotic metabolism）。因此，研究人员利用分化的HepaRG细胞分别用氟哌啶醇（1–100 μM HLP，磷脂蓄积症诱导剂）和三苯基磷酸（1–100 μM TPP，脂肪变性诱导剂）进行单独处理和联合处理（其中分别联合25 μM TPP或20 μM HLP）。当TPP与HLP同时存在于混合物中时，TPP诱导的脂肪变性减弱，这种拮抗效应很可能是由于转录水平（transcriptional level）的相互作用所致。此外，毒物代谢动力学研究表明细胞色素P450（cytochrome P450, CYP）的表达和活性降低，导致该混合物对细胞存活率产生协同效应（synergistic effects），同时HLP诱导的磷脂蓄积症也略有增加。总之，所研究的HLP和TPP混合物对肝脏脂质和异生物代谢表现出非加和性效应（non-additive effects），并具有复杂的毒效动力学与毒物代谢动力学相互作用。这些发现突显了预测混合相互作用以用于风险评估所面临的挑战。
肝细胞在维持健康的脂质稳态中发挥关键作用，而肝脏脂质代谢的改变与脂肪肝、肥胖和糖尿病等多种疾病显著相关。代谢干扰物（metabolism-disrupting chemicals, MDCs）被认为可能通过影响肝脏脂质代谢相关通路促进上述疾病的进展，导致适应性或不良效应。其中，化学物质可诱导两种重要的肝脏改变：一是脂肪变性（steatosis，即肝细胞内甘油三酯的异常蓄积）；二是磷脂蓄积症（phospholipidosis，即磷脂在细胞内的异常蓄积，其深层机制迄今仍未完全阐明）。然而，传统毒理学研究与风险评估主要聚焦于单一化合物的暴露，并通常假设混合物的剂量加和性（dose addition）成立，这并不能很好地反映现实生活中的真实暴露场景。尤其对于作用模式（mode of action, MoA）不同的化合物，其联合暴露的效应可能显著偏离加和性预测，表现出拮抗或协同效应，其中协同效应尤为引人担忧。既往研究虽已报道了毒效动力学（toxicodynamic，即外源因素对生物系统作用的机制）和毒物代谢动力学（toxicokinetic，即外源物质在生物体内的吸收、分布、代谢与排泄过程）相互作用，但据研究人员所知，尚无研究探讨过化学混合物对磷脂蓄积症的影响，亦缺乏对磷脂蓄积症诱导剂与脂肪变性诱导剂联合效应的考察。由于这两种终点均代表肝脏脂质稳态的改变，它们之间可能存在内在关联。为填补这一空白，研究人员开展了本研究。该论文发表在《Archives of Toxicology》上。
为系统评估两种作用机制不同化合物联合暴露的混合效应，研究人员以分化的HepaRG细胞（一种体外人肝细胞模型）为对象，选取氟哌啶醇（haloperidol, HLP）作为磷脂蓄积症诱导剂，三苯基磷酸（triphenyl phosphate, TPP）作为脂肪变性诱导剂，开展了系统的体外毒理学研究。研究旨在探讨二者在单独及联合暴露下对肝脏脂质代谢与异生物代谢（xenobiotic metabolism，指外源性化学物质在生物体内的转化过程）的影响。关键的技术方法包括：利用WST-1试验和中性红摄取（Neutral Red Uptake, NRU）试验评估细胞存活率；采用AdipoRed试验检测细胞内甘油三酯含量以评价脂肪变性；通过LipidTOX Red试验检测磷脂蓄积症；利用溶菌磷脂酶A2（lysosomal phospholipase A2, LPLA2）抑制试验探究磷脂蓄积症的作用机制；运用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）分析脂质代谢相关基因及CYP基因的表达变化；采用7-甲氧基-异吩噁唑-O-脱甲基（MROD）试验检测CYP1A2活性及P450-Glo CYP3A4试验检测CYP3A4活性；使用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC–MS/MS）和气相色谱-串联质谱（gas chromatography-tandem mass spectrometry, GC–MS/MS）对细胞培养上清中的HLP和TPP进行定量；并应用理论加和性（theoretical additivity, TA）、浓度加和性（concentration addition, CA）和独立作用（independent action, IA）三种数学模型计算组合指数（combination index, CI）以判定协同、加和或拮抗效应。
在结果部分，研究人员系统考察了一系列毒理学终点。在**Synergistic mixture effects on cell viability（联合处理对细胞存活的协同混合效应）**方面，WST-1试验表明，HLP单独处理在浓度高于100 μM时降低HepaRG细胞存活率，而HLP与25 μM TPP联合暴露时，在浓度高于200 μM时细胞存活率下降更为明显；TPP单独处理在浓度高于135 μM时显著降低细胞存活率，而当TPP与20 μM HLP联合时，在75 μM TPP时即显著降低存活率，浓度-反应曲线明显左移。NRU试验验证了上述结果。CI值计算显示，两种组合在细胞存活率上均表现出协同效应。
在**Combination effects on lipid metabolism（脂质代谢的组合效应）**方面，LipidTOX试验显示，HLP单独处理引起磷脂含量浓度依赖性增加，加入25 μM TPP未改变该效应；TPP单独处理对磷脂含量无显著影响。然而，TPP与20 μM HLP联合时，在75 μM TPP浓度下磷脂含量升至对照组的600%，且此浓度下细胞存活率降低，CI计算显示该高浓度下存在协同效应。AdipoRed试验显示，HLP单独处理对甘油三酯含量无显著影响，而TPP单独处理显著增加甘油三酯蓄积。当TPP与HLP联合时，HLP以浓度依赖性方式减弱TPP诱导的甘油三酯蓄积，在20 μM HLP以上几乎完全阻断该效应。CI值显示两种混合物对甘油三酯蓄积主要表现为拮抗效应。
在**No combination effects on LPLA2 inhibition（对LPLA2抑制无组合效应）**方面，LPLA2抑制试验发现，HLP单独处理浓度依赖性地抑制LPLA2酶活性，加入25 μM TPP未产生显著差异；TPP单独处理对LPLA2活性无显著影响。CI计算证实混合物对LPLA2抑制主要表现为加和效应，表明观察到的磷脂蓄积症组合效应并非由LPLA2的毒效动力学相互作用引起。
在**Regulation of lipid-metabolism-related genes（脂质代谢相关基因的调控）**方面，qRT-PCR分析发现，ACSS1、APOB、FABP4和MTTP等基因在联合处理时表现出更显著的变化。TPP对FABP4的上调在联合HLP后受到拮抗，这与脂肪变性的拮抗效应一致；而ACSS1、APOB和MTTP在联合处理后呈现协同下调。基因表达变化表明，联合处理在转录水平对脂质代谢通路产生了显著影响。
在**Reduced CYP activity upon combination treatment（联合处理后CYP活性降低）**方面，P450-Glo CYP3A4试验和MROD试验发现，TPP浓度依赖性地降低CYP3A4和CYP1A2活性。HLP单独处理对CYP3A4活性影响较小，而联合处理则显著降低CYP3A4活性，并降低CYP1A2活性。CI计算显示两种混合物对CYP3A4活性均表现为协同抑制效应，对CYP1A2活性也呈现协同降低趋势。
在**Quantification of TPP and HLP in cell culture supernatants（细胞培养上清中TPP和HLP的定量）**方面，LC–MS/MS和GC–MS/MS结果显示，与HLP单独处理相比，联合处理时上清中HLP残留量显著增加，提示TPP可能通过抑制CYP3A4介导的HLP代谢而降低其清除率；TPP残留量在单独和联合处理间无显著差异。
在讨论部分，研究人员指出，由于肝脏脂质稳态和脂肪变性诱导的复杂性，对所有潜在毒效动力学靶点进行全面测试被认为超出本研究范围，因此未能完全阐明脂肪变性和磷脂蓄积症诱导之间的详细交互作用。研究发现，HLP和TPP联合暴露对脂肪变性的拮抗效应可能主要由毒效动力学相互作用驱动，特别是TPP依赖性的FABP4上调被HLP拮抗，从而减少了脂肪酸转运和甘油三酯蓄积。相反，混合物对磷脂蓄积症的协同增强作用以及细胞存活率的协同降低，可能与毒物代谢动力学相互作用有关：TPP抑制CYP3A4和CYP1A2的活性并下调其基因表达，导致HLP代谢受阻、细胞外HLP浓度升高，进而增强其磷脂蓄积症诱导效应和细胞毒性。研究还指出，HLP和TPP的联合暴露对CYP酶的抑制可能源于转录调控而非直接酶抑制，因为单独处理时酶活性和基因表达的变化并不同步，而联合处理时基因表达的下调与酶活性降低相一致。研究人员强调，基于单一化合物的风险评估数据可能不足以预测混合物的真实毒性，尤其是在存在毒物代谢动力学相互作用的情况下。新替代方法学（new approach methodologies, NAMs）的应用，如本研究中所采用的多种体外试验，对于评估不同终点、揭示毒效动力学和毒物代谢动力学效应以及改进混合物风险评估具有重要价值。
总之，所研究的HLP和TPP混合物对脂肪变性诱导表现出拮抗效应，而对异生物代谢和细胞存活率表现出协同效应。这些发现突显了毒效动力学和毒物代谢动力学之间复杂的相互作用以及预测混合效应的挑战，因为本研究中大多数考察的终点均偏离了加和性。研究人员进一步证明，新替代方法学（new approach methodologies, NAMs）可用于评估不同终点，是评估混合物风险的有用工具，能够揭示毒效动力学和毒物代谢动力学效应。
