甲状腺激素系统干扰物识别的测试策略：整合计算模拟、体外与体内方法的监管导向框架

《Archives of Toxicology》：Testing strategy for the identification of thyroid hormone system disrupting chemicals

　　

甲状腺激素（TH，Thyroid Hormone）系统在胎儿和新生儿生命早期的紊乱对人类神经发育构成重大风险，然而目前的监管评估缺乏足够灵敏和特异的终点指标来识别引起甲状腺激素系统干扰（THSD）的化学物质。ATHENA项目旨在开发整合计算模拟（in silico）、体外（in vitro）与体内（in vivo）方法的综合框架，以提高THSD物质的识别能力并在监管背景下支持其评估。该测试策略强调增加使用不良结局路径（AOP，Adverse Outcome Pathways）框架与读源法（read-across），以更好地预测和应对危害。研究进一步为计算模拟和体外测试组合以及针对性的体内研究提出推荐，以提高THSD化学物质的识别能力。此外，研究人员建议对当前监管实践加以改进，包括进一步标准化测试方法、更好地整合人类流行病学与跨物种证据，以及将动物研究中血清和脑TH浓度的变化视为人类不良神经发育结局的预测因子。综上所述，这些措施旨在通过更稳健、更高效的THSD识别加强化学危害评估，从而改善人类健康与环境防护。

研究背景、存在问题与研究必要性：甲状腺激素（TH，Thyroid Hormone）系统在胎儿和新生儿生命早期对神经发育至关重要。人群流行病学提供强有力证据，将母体甲状腺功能减退与子代不良神经发育结局相关联，先天性甲状腺功能减退亦证实生命早期TH缺乏与远期神经发育障碍相关（包括注意力缺陷多动障碍（ADHD，attention-deficit/hyperactivity disorder）风险和认知缺陷）；尽管新生儿筛查和T4治疗已减少受累儿童数量，环境甲状腺激素系统干扰（THSD，TH System Disrupting chemicals）化学物质所致不良神经发育效应仍表征不足，原因是评估TH缺乏介导神经发育效应的敏感测试方法尚属空白。TH系统（THS，TH System）复杂且可被扰乱的环节众多：前激素T4仅由甲状腺产生，高达80%的生物活性激素三碘甲状腺原氨酸（T3）在甲状腺外经脱iodinase 1型（DIO1）与2型（DIO2）对T4的转化生成，且可于脑和性腺等靶组织局部发生；由于T3与细胞内TH受体（TR，Thyroid Receptor）结合介导大部分TH效应，干扰可发生于激素合成之外的分布、代谢以及基因组与非基因组作用多个层面。历史上毒理研究主要评估循环TH浓度与甲状腺腺体改变，但这些终点仅覆盖THS一部分；单羧酸转运蛋白8（MCT8，Monocarboxylate Transporter 8）和有机阴离子转运多肽1C1（OATP1C1，Organic Anion Transporting Polypeptide 1C1）等跨膜转运体基因突变所致Allan-Herndon-Dudley综合征表明，即使循环TH水平正常或升高，靶组织TH可用性障碍仍可造成严重脑低甲状腺素与严重神经发育损害，因此识别THSD必须纳入THS全部组分。T模态为四大内分泌模态EATS（雌激素E、雄激素A、甲状腺T、类固醇生成S）之一，目前尚无经OECD（经济合作与发展组织）验证的T模态体外方法；且THS是脊椎动物中进化上最高度保守的内分泌信号系统，该特性对啮齿类结果外推至人类及非哺乳动物数据解读均至关重要。基于上述背景，欧洲委员会于2019年资助的EURION集群（含八个研究项目）中的ATHENA项目（2019—2024）致力于改进THSD识别，本文据此提出该整合性测试策略。

研究人员开展的工作、结论与意义：研究人员以FREIA项目（van Duursen et al.）形成的策略为基础，构建了针对THS干扰物识别与评估的五步迭代式测试策略（属整合测试与评估方法（IATA，Integrated Approaches to Testing and Assessment）），论文发表于《Archives of Toxicology》。策略尤其适用于缺乏或仅有有限啮齿类体内数据的物质（如REACH（化学品注册、评估、授权与限制法规）低吨位注册物质）。核心结论为：通过优先化的计算模拟与体外方法组合、不良结局路径（AOP，Adverse Outcome Pathways）与读源法（read-across）推断危害、针对性体内研究澄清不良效应，并将血清和脑TH浓度变化认定为不良神经发育结局预测因子，可在符合3R原则（Replacement、Reduction、Refinement）与证据权重（WoE，Weight of Evidence）评估的前提下更稳健、高效地识别THSD，为化学危害评估提供更机制化、更人相关且更合乎伦理的途径。

主要关键技术与数据来源：关键技术为五步迭代式IATA框架：文献与公开数据库检索及（定量）结构活性关系（（Q)SAR，(Quantitative) Structure Activity Relationship）模型预测（含OECD QSAR Toolbox预测ADME（吸收、分布、代谢和排泄）途径）；优先化的分子起始事件（MIE，Molecular Initiating Event）导向体外组合，涵盖甲状腺过氧化物酶（TPO，Thyroperoxidase）、钠/碘同向转运体（NIS，Na⁺/I^- symporter）、DIO1、甲状腺素转运蛋白（TTR，Transthyretin）、TR和MCT8等靶点的抑制/结合试验；经OECD认可的AOP、AOP网络、读源法及啮齿类体内研究（含比较甲状腺分析（CTA，Comparative Thyroid Assay））。数据来源包括开放文献、公开数据库、人用药品临床数据、非哺乳动物脊椎动物（非洲爪蟾幼体甲状腺分析（XETA，Xenopus Eleutheroembryo Thyroid Assay，TG 248）、鱼类胚胎试验（FET，Fish Embryo Test，TG 236））及啮齿类发育研究。

研究结果：STEP 1 – 数据收集：编译文献、数据库、（Q)SAR预测、体内及人流行病学数据；目标物质信息不足时编译结构/机制相似源物质数据，必要时检索已有读源评估与代谢物信息并预测ADME途径。STEP 2 – 机制数据缺口填补：针对T模态机制缺口开展靶向体外测试（可涵盖源物质）；若母体化合物及相关代谢物均无T模态活性迹象，可得出结论：现有证据不支持将该物质（就T模态而言）认定为内分泌干扰物（EDC，Endocrine Disrupting Chemical）。STEP 3 – AOP与读源法/分组推断危害：对缺乏稳健体内数据的物质，以读源法与分组推断潜在危害；整合成熟（优选经OECD认可）AOP提供生物学合理性，证据可由生理药代动力学模型（PBPK，Physiologically Based Pharmacokinetic）内部暴露预测与定量体外体内外推（QIVIVE，Quantitative in vitro–in vivo extrapolation）强化；纳入非哺乳动物脊椎动物（含胚胎生活史阶段）危害数据支持跨物种外推；若证据充分可直接认定EDC，否则继续步骤4。STEP 4 – 针对性体内测试：啮齿类靶向研究解决体内内分泌活性与危害的残余不确定性；受胎儿及出生后TH不足特异影响的脑内终点包括脑室周围结节性异位等神经元迁移错误、皮质与海马基因表达失调、小清蛋白阳性中间神经元改变、脑组织TH浓度（T3、T4）显著降低等，与常规THS相关终点共同填补危害缺口。STEP 5 – 信息整合：按现行ED识别指南评估所有信息，判定物质是否构成T模态EDC或数据不足。Recommended in silico and in vitro batteries for the T-modality：推荐优先化MIE导向体外组合全面识别THSD机制警示；FITC-T4 TTR结合、DIO1抑制和TPO抑制获OECD甲状腺干扰方法专家组（TDM-EG）积极评价进入进一步验证，其中DIO1与FITC-T4在PEPPER平台进入C阶段盲编码环试；NIS抑制与MCT8抑制因预验证中止未获部分验证，策略基于其MIE重要性优先纳入并鼓励以其他过表达细胞系推进验证（MCT8现由ThyroTransVal项目承担）；TRHR与TSHR激活试验因验证不足暂未纳入；TH葡糖醛酸化试验因毒理学相关性存疑被排除。Recommended in vivo investigations to clarify adversity for the T-modality：传统以甲状腺滤泡细胞组织病理与甲状腺增重为T介导危害的诊断依据，脑重量、神经病理、脑形态测量、听觉惊跳、功能观察组合、运动活性等神经发育终点仅被视为"敏感但非诊断性"；探索性研究显示TH不足可致上述终点改变，但需晚胎儿期与早出生后持续大幅TH降低方触发；流行病学显示人TH水平小而短暂变化即可导致显著持久的神经发育效应，提示标准啮齿类模型可能低估发育中人脑的敏感性；近期AOP网络将母体与胎儿TH浓度变化确立为与不良神经发育结局因果关联的中心节点关键事件，故策略提议将血清和脑TH浓度的统计学显著变化（无论方向）认定为危害预测因子。

讨论部分总结：讨论指出，该策略与ECHA/EFSA指南及CLP（分类、标签和包装法规）指南高度一致，推动更大程度依赖读源法、AOP知情评估与跨物种整合以符合3R原则与淘汰动物研究的路线图；分组与读源法的相似性概念由结构相似扩展至机制、毒代动力学与通路关系相似（依EFSA读源法应用指南）；XETA与扩展THSD敏感终点的鱼类胚胎试验属新approach方法学（NAM，New Approach Methodologies），可在AOP框架与机制性跨物种证据支持下确立人类健康相关性的生物学合理性；以肝酶诱导为案例，rifampicin、phenytoin、carbamazepine、bexarotene等人体证据表明该机制降低循环T4的模式并非啮齿类特有、应认定为人相关，建议修订CLP指南STOT-RE（特异性靶器官毒性-反复暴露）章节以与ED分类保持一致；认为ECETOC与CropLife Europe的Thyroid-NDT-TAS方案（Melching-Kollmuss et al.）对流行病学、读源法与跨物种证据考虑有限，早期排除某些机制可能造成假阴性，且其大规模体内测试不符合3R原则；并提出四项建议：承认TH浓度变化为危害预测因子、增加人流行病学数据整合、增加AOP与读源法运用、持续推进NAM开发与验证（NAM无法识别敏感发育窗口，需结合发育生物学、流行病学与体内时序数据）。

研究结论（翻译）：ATHENA测试策略为识别THSD提供了全面且机制明确的途径，尤其适用于体内数据有限的物质；通过在结构化测试与评估策略中整合计算模拟、体外与体内方法，为评估化学对TH系统的影响提供了科学稳健且高效的途径。其核心在于利用机制证据支持监管决策，包括将TH浓度变化认定为危害预测因子；计算模型、生物试验与靶向动物或流行病学研究的整合使透明、证据权重的ED评估成为可能。推荐的体外测试组合及分组与读源法的强化应用，提升了识别THS介导效应的能力。该策略的实施将促进更早、更准确地识别THSD物质，减少对动物试验的依赖并改善人类健康与环境防护；体外试验的持续改进、AOP网络的扩展及流行病学数据的整合将进一步增强其预测与监管效力，代表了迈向更机制化、更人相关且更合乎伦理的化学危害评估的重要一步。