六种新型甲基噻吩卡西酮在不同人肝系统中的体外代谢比较研究及单加氧酶鉴定

《Archives of Toxicology》：Comparative in vitro metabolic profiling of six novel methylthiophene cathinones using different human liver systems and LC-HRMS/MS

合成卡西酮（synthetic cathinones）代表了一大类与新型精神活性物质（new psychoactive substances）相关并伴有严重毒理学风险的物质。治疗性卡西酮衍生物如安非泼拉酮（amfepramone，食欲抑制剂）因严重副作用已部分退出市场。p-甲苯取代的合成卡西酮主要作为新型精神活性物质而为人所知，并与严重不良事件和滥用可能性相关。将p-甲苯环通过生物电子等排替换（bioisosteric replacement）为5′-甲基噻吩部分近期已成为该化合物类别中的一种结构优化策略，并推动了甲基噻吩的评估，后者作为一类新型卡西酮类似物出现。了解其肝脏生物转化对于可靠的毒理学检测和风险评估至关重要。研究人员利用混合人肝微粒体（pooled human liver microsomes, pHLM）、混合人肝S9组分（pooled human liver S9 fraction, pHLS9）和HepG2细胞，调查了六种新型甲基噻吩卡西酮——5Me-NM-BT（5-甲基-N-甲基-丁噻吩酮）、5Me-NM-VT（5-甲基-N-甲基-戊噻吩酮）、5Me-NE-BT（5-甲基-N-乙基-丁噻吩酮）、5Me-NE-VT（5-甲基-N-乙基-戊噻吩酮）、5Me-αP-BT（5-甲基-α-吡咯烷基-丁噻吩酮）和5Me-αP-VT（5-甲基-α-吡咯烷基-戊噻吩酮）的体外肝脏代谢。代谢物通过反相液相色谱（reversed-phase liquid chromatography, RPLC）与亲水相互作用液相色谱（hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC）耦合高分辨串联质谱（high-resolution tandem mass spectrometry, HRMS/MS）进行表征。此外，研究人员筛选了重组人单加氧酶（recombinant human monooxygenases），以鉴定介导初始阶段I（phase I）步骤的异构酶。总共可推测性鉴定出48个阶段I和两个阶段II（phase II）代谢物。在每个亚组内，化合物表现出相似的代谢特征。异构酶图谱显示多种酶的贡献一致，包括CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4，提示基于代谢物的药物–药物相互作用（metabolism-based drug–drug interactions, DDI）或单酶多态性影响（single-enzyme polymorphism impact）的风险较低。在所有模型中，5′-甲基上的羟基化代谢物始终丰富，并与相应的母体化合物一起，代表有前景的毒理学筛查分析目标。

合成卡西酮（synthetic cathinones）在化学结构上与苯丙胺（amphetamines）密切相关，其区别在于侧链存在额外的β-酮基（β-keto group）。部分卡西酮衍生物最初被开发用于医疗目的，例如食欲抑制剂安非泼拉酮（amfepramone），但因心血管、精神及滥用相关风险，其治疗获益与毒理学风险之间的平衡不佳，已被监管机构限制或撤市。此外，合成卡西酮已大量涌现为新型精神活性物质（new psychoactive substances, NPS），因其高滥用潜能和不可预测的毒理学特征，对公共卫生构成重大威胁。其中，p-甲苯取代的卡西酮衍生物通过与单胺转运体直接相互作用，促进多巴胺、去甲肾上腺素和/或血清素的释放或抑制其再摄取，从而产生中枢神经兴奋和厌食效应，这也解释了其滥用可能性和毒理学风险。在药物开发中，生物电子等排替换是调节药理活性、改善理化性质或降低全身毒性的基础策略，典型应用是将芳香苯环替换为杂环如噻吩（thiophene）。非法药物市场亦采用类似的结构修饰策略生成新衍生物以规避现有法规并挑战已建立的分析方法。近期，5′-甲基噻吩取代的卡西酮已被探索作为经典p-甲苯取代卡西酮的生物电子等排类似物。尽管该结构修饰可能规避某些国家的法规，但也可能伴随毒物动力学性质的改变。虽然假设其代谢命运与密切相关的卡西酮衍生物相似，但其代谢途径不能简单外推。因此，详细阐明其生物转化途径对于明确代谢命运、鉴定分析性质及未来识别人体内生物标志物具有重要的前置意义。

基于上述背景，研究人员在《Archives of Toxicology》上发表论文，首次系统性地调查了六种新型甲基噻吩卡西酮衍生物（5Me-NM-BT、5Me-NE-BT、5Me-NM-VT、5Me-NE-VT、5Me-αP-BT、5Me-αP-VT）的体外肝脏代谢与毒物动力学特征。研究人员采用互补的体外工作流程，结合混合人肝微粒体（pooled human liver microsomes, pHLM）、混合人肝S9组分（pooled human liver S9 fraction, pHLS9）和HepG2细胞三种模型，通过液相色谱耦合高分辨串联质谱进行代谢物鉴定，并筛选出关键的代谢生物标志物，以期为毒理学尿液筛查提供分析目标。研究得出以下核心结论：5′-甲基噻吩部分的羟基化是所有化合物和肝脏系统中最丰富的生物转化途径；初始阶段I代谢由多种酶介导，提示基于代谢物的药物–药物相互作用、单酶抑制或遗传多态性导致严重毒性或清除改变的风险较低；5′-甲基羟基化代谢物可作为与母体化合物联用的潜在尿液筛查靶点。这些生物分析数据构成了检测和监测此类新兴精神活性物质的关键基础。

为开展本研究，研究人员采用了几项关键的技术方法。样本方面，pHLM和pHLS9分别来源于35名和150名供体。研究人员将六种合成卡西酮与上述三种人体外肝脏系统共同孵育，经蛋白质沉淀或固相萃取（solid-phase extraction, SPE）等样品前处理后，采用反相液相色谱（reversed-phase liquid chromatography, RPLC）和亲水相互作用液相色谱（hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC）耦合高分辨串联质谱（liquid chromatography-high-resolution tandem mass spectrometry, LC-HRMS/MS），通过设定前体离子（precursor ion, PI）质量偏差不超过5 ppm，并将推测性质谱图与母体化合物进行比对及碎片离子（fragment ion, FI）解释，实现代谢物的结构推测。此外，研究人员利用10种重组人细胞色素P450异构酶（cytochrome P450, CYP）（CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5）和黄素单加氧酶3（flavin-containing monooxygenase 3, FMO3）进行单加氧酶筛选，以鉴定催化初始阶段I反应的特定同工酶。

Identification of metabolites方面，研究人员基于精确质量（偏差<5 ppm）和MS2碎裂行为，推测性鉴定出50个代谢物（48个阶段I和2个阶段II）。代表性化合物如5Me-NE-VT的N-去乙基化通过质量偏移?28 u（C₂H₄）及特征碎片离子确认；5′-甲基的羟基化通过+16 u质量偏移及后续脱水、脱甲醛（?30 u, CH₂O）碎裂模式确证，明显区别于芳香环羟基化。对于5Me-αP-VT，N,N-双去烷基化（M6.1）、5′-甲基氧化为醛（M6.2）及羧酸（M6.8）、吡咯烷环羟基化（M6.5）与N-氧化（M6.6）亦通过相应碎片离子得以确证。其中O-葡萄糖醛酸化通过中性丢失葡萄糖醛酸（?176 u, C₆H₈O₆）得以识别。六种母体化合物表现出相似的碎裂行为，如相邻羰基和仲胺的α-裂解及中性丢失。

In vitro metabolic pathways方面，六种化合物共产生50个代谢物，其中二级胺组28个，三级胺组22个。pHLM孵育提供了最全面的阶段I代谢谱，而pHLS9和HepG2在主要代谢物定性上一致。对于全部六种衍生物，5′-甲基的羟基化（M1.3、M2.5、M3.5、M4.5、5.4、6.4）是所有系统中最主要的阶段I反应，其次为N-去烷基化（M1.1、M2.1、M3.1、M4.1，二级胺）及吡咯烷环的羟基化与内酰胺形成（M5.5、M5.9、M6.5、M6.11，三级胺）。值得注意的是，β-酮还原在所有二级胺中均未检测到，这与合成卡西酮中常见的该途径不同。羧化代谢物在pHLM和pHLS9中高丰度存在，但在HepG2中未能检出；醛类、羟胺类及烷基链羟基化代谢物在pHLM中作为次要代谢物出现。

Monooxygenases activity screening方面，所有在单个异构酶孵育中鉴定的代谢物也在相应pHLM对照中检出。N-去烷基化主要由CYP2B6、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4和CYP3A5催化；N-氧化由FMO3、CYP3A4和CYP3A5介导。羟基化具有部位依赖性差异：吡咯烷环的羟基化及后续氧化由CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4和CYP3A5催化；戊酮类的烷基链羟基化主要由CYP3A4和CYP3A5介导；而5′-甲基的羟基化主要由CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19和CYP2D6催化，未检测到CYP3A4或CYP3A5的参与。进一步氧化为醛和羧酸涉及CYP1A2、CYP2C19和特别是CYP2D6。总之，同系物表现出相似的异构酶谱，其中CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4在所有六种化合物的阶段I生物转化中贡献最大。

Complementary chromatographic separation方面，由于HILIC和RPLC基于根本不同的保留机制，两者相互补充。通常两种色谱系统均适用于检测所有六种衍生物。RPLC分离通常产生更优的峰形及更高的MS1丰度和MS2碎片离子强度。相比之下，HILIC中若干代谢物（如M2.4、M3.6、M4.4、M5.2和M6.5）未被检出，另一些（如M1.4、M2.6、M3.3和M4.3）过早洗脱（约0.7 min），可能损害可靠鉴定。

在讨论部分，研究人员指出，在所测试的甲基噻吩衍生物中，5′-甲基的羟基化是最丰富的生物转化反应，这与生物电子等排p-甲苯取代卡西酮中4′-甲基羟基化及进一步氧化为羧酸的主要途径一致。三级胺因涉及吡咯环的额外代谢途径而经历更广泛的代谢。与4-MPD不同，β-酮还原在本研究所有二级胺中均未检测到，该发现出乎意料，可能表明5′-甲基噻吩部分影响了β-酮基团对酶还原的敏感性。体内数据显示部分对比模式，提示体外发现可为未来体内研究提供指导，但个体代谢物的相对贡献强烈依赖于实验条件和所用系统。单加氧酶谱表明，由于多种异构酶参与主要代谢物形成，单酶抑制或活性降低可被其他酶补偿，因此酶抑制、药物–药物相互作用及个体间酶活差异不太可能实质影响肝脏清除；然而数据仅为定性性质，不允许估算各酶对清除的定量贡献。在HepG2系统中，羧化代谢物未检出，可能反映HepG2细胞中CYP2D低表达及基于阳离子交换的提取对回收率的限制。尽管HepaRG细胞通常产生更丰富的代谢物，HepG2仍因操作简便和成本较低而作为有价值的互补模型。关于色谱分离，RPLC本身足以鉴定大多数代谢物，而仅依赖HILIC则不太适合，因部分代谢物无法检出或保留过弱。对于毒理学尿液筛查，5′-甲基羟基化产物是最丰富的代谢物，可作为与母体化合物联用的关键筛查目标，但其作为可靠生物标志物的适用性仍须体内数据确认。此外，N-去烷基化产物不允许在特定类似物间明确分配，因其仅N-取代不同，故分析时需谨慎解释。

本研究结论如下：本研究首次利用pHLM、pHLS9、HepG2细胞模型和重组单加氧酶活性筛选，对六种新型生物电子等排甲基噻吩卡西酮衍生物的体外肝脏代谢和毒物动力学谱进行了系统研究。通过互补的RPLC-和HILIC-HRMS/MS工作流程，共检测并表征了50个代谢物（48个阶段I和2个阶段II）。5′-甲基噻吩部分的羟基化是所有化合物和肝脏系统中最丰富的生物转化。活性筛选表明初始阶段I代谢由多种酶介导，包括CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4/5和FMO3。这表明由于药物–药物相互作用、单酶抑制或遗传多态性导致的清除改变或严重毒性的风险降低。对于临床和法医毒理学尿液筛查，建议将5′-甲基羟基化代谢物与母体化合物一起作为分析目标。这些生物分析数据构成了检测和监测生物基质中新兴甲基噻吩卡西酮的关键基础。