《Cell and Tissue Research》：The systemic administration of multipotent mesenchymal stromal cells alters the inflammatory response in the lung during murine polymicrobial sepsis
脓毒症（Sepsis）是一种危及生命的器官功能障碍，也是急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的主要病因。间充质基质细胞（MSCs）已成为一种潜在的免疫调节疗法，但临床前数据仍不一致。本研究探讨了来源于不同组织——骨髓（BMMSCs）和脂肪组织（ASCs）——的人MSCs对多微生物脓毒症小鼠模型全身及肺部炎症的早期影响。60只雄性C57BL/6小鼠接受假手术处理、盲肠结扎穿刺（CLP）或CLP后单次静脉给予按GMP合规方案制备的BMMSCs或ASCs。分析于CLP后8、24和72 h进行。全身炎症介质通过多因子分析定量，肺部炎症通过mRNA和蛋白表达、组织学和免疫荧光评估。CLP诱导全身促炎介质水平升高，MSC治疗未显著降低这些水平。然而在肺组织中，MSC给药产生了选择性免疫调节效应。两个MSC治疗组的NLR家族 pyrin 结构域包含3（Nlrp3）表达均降低，而ASC治疗在早期时间点还额外降低了肺部白介素6（Il6）和补体3a受体（C3ar）mRNA表达。IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平未显著改变，尽管ASC治疗后NLRP3蛋白表达降低。各组间组织学肺损伤评分无显著差异。总之，MSC治疗在多微生物脓毒症中诱导了适度的、时间依赖性的肺部炎症反应减弱，但未改善结构性肺损伤。BMMSC与ASC治疗组之间在肺部炎症基因表达、蛋白水平或组织学肺损伤评分方面未观察到显著差异，表明在该模型所评估的分子终点上，两种来源均未展现出明显的免疫调节优势。
脓毒症（Sepsis）是一种由宿主对感染反应失调所致的危及生命的器官功能障碍，常累及肺部，是急性呼吸窘迫综合征（ARDS）最常见的潜在病因。脓毒症相关ARDS死亡率高达40%，高于非脓毒性病因所致ARDS。组织学上，ARDS以弥漫性肺泡损伤为特征，由内皮功能障碍和炎症驱动，表现包括肺泡内水肿、炎症细胞浸润、透明膜形成和肺泡出血，最终损害气体交换导致严重低氧血症。脓毒症期间，损伤相关分子模式（DAMPs）、细胞因子和补体激活产物等促炎介质全身性升高，与ARDS发生、严重程度及死亡率相关。脓毒症管理包括早期血流动力学稳定、及时抗菌治疗和感染源控制。直接靶向炎症反应以减轻损伤并改善预后的治疗策略具有前景。除糖皮质激素外，越来越多证据表明基于间充质基质细胞（MSC）的疗法是脓毒症或ARDS等宿主炎症性疾病的有前景方法。实验研究显示干细胞疗法在脓毒症模型中的早期有益效应：静脉给予小鼠骨髓来源MSCs（BMMSCs）在CLP脓毒症模型中显著改善器官功能，表现为血清肌酐降低和生存率提高，并观察到血浆促炎细胞因子水平降低、肺泡炎症细胞和细胞因子减少。MSCs的有益效应主要通过旁分泌机制介导，包括通过白介素-1受体拮抗蛋白（IL-1ra）抑制巨噬细胞TNF-α产生，以及通过前列腺素E2（PGE2）增强巨噬细胞产生抗炎细胞因子IL-10。这些发现提示巨噬细胞可能是MSC疗法的关键靶点。此外，MSCs可影响巨噬细胞细胞因子产生并诱导向抗炎M2型巨噬细胞极化。MSCs可从多种组织来源分离，包括骨髓、脂肪组织和脐带组织。然而，MSC的组织来源是否影响其免疫调节潜力仍存争议，导致基于MSC的脓毒症疗法结果不一致，临床应用中MSC分离的最佳组织来源持续存在争论。既往实验研究显示MSCs免疫调节潜力存在显著差异，对巨噬细胞、T细胞和B细胞增殖的影响不同，似乎取决于组织来源及供体来源。本研究使用的人BMMSCs和脂肪组织来源MSCs（ASCs）按已在多项临床试验中应用的GMP合规方案制备。人MSCs在小鼠模型中的异种给药已有先例，未见到移植物抗宿主反应的描述。然而，这些MSCs在脓毒症期间的效果，特别是其对全身和局部肺部炎症反应的免疫调节潜力尚未被描述。因此，本研究旨在探究CLP脓毒症小鼠肺部ARDS的发展，并评估不同组织来源（骨髓 vs. 脂肪组织）人MSC治疗能否改善炎症。
研究人员开展了以下研究：BMMSCs和ASCs按GMP合规规则制备，BMMSCs来源于两名健康男性志愿者（23岁和27岁）的髂嵴骨髓穿刺液，ASCs来源于两名健康志愿者的皮下脂肪组织。两种细胞均表达身份标志物CD90、CD73、CD105等，缺乏杂质标志物CD3、CD14、CD34、CD45和HLA II类表达，活力率达90%。60只雄性C57BL/6小鼠（10-12周龄，25-30 g）随机分为假手术组、CLP组、CLP+BMMSC组和CLP+ASC组，每组n=5，于CLP后8、24和72 h处死。CLP手术按Rittirsch等所述方法进行，cecum于回盲瓣和盲肠尖之间中点结扎，用22-G针穿刺。CLP动物在手术和液体复苏完成后随机分配至3个治疗组：PBS、BMMSC和ASC。BMMSC组和ASC组动物各接受1×10
6个细胞重悬于250 μl DPBS中，经尾静脉注射。假手术小鼠接受等量无菌PBS。观察期分别为8 h（n=20）、24 h（n=20）和72 h（n=20）。处死后取心脏血，离心收集血浆保存于-80 °C。肺组织一半液氮速冻，一半4%多聚甲醛固定48 h。全身炎症介质采用Bio-Plex Pro Mouse Chemokine Assay和Bio-Plex 200系统分析血浆中GM-CSF、IL-6、KC/CXCL1、MCP1/CCL2和IP-10/CXCL10。肺组织RNA采用AllPrep DNA/RNA/miRNA Universal Kit分离，SuperScript IV VILO MasterMix逆转录为cDNA，PowerUp SYBR Green Master Mix和QuantStudio3系统进行定量PCR，检测小鼠
C3ar、
C5ar1、
Il1b、
Il6、
Nlrp3、
Tlr2、
Tlr9和
Tnfa的mRNA表达，以
Gapdh为参照基因，采用ΔΔCt法计算相对基因表达。蛋白提取使用RIPA缓冲液，BCA法定量，7-10% TGX Stain-Free凝胶电泳，转印至PVDF膜，分别孵育IL-1β（abcam ab205924，1:1000，定量约31 kDa pro-IL-1β前体条带）、TNFα（abcam ab6671，1:500）、IL-6（abcam ab208113，1:1000）和NLRP3（abcam ab263899，1:1000）一抗过夜4 °C，二抗室温1 h，ChemiDoc MP成像系统分析，蛋白表达以总泳道蛋白归一化。免疫荧光使用石蜡包埋肺组织切片，柠檬酸缓冲液抗原修复，10%山羊血清封闭，CD163一抗（AlexaFluor 488标记，Bioss bs-23127R-A488）过夜4 °C，Hoechst33342复染细胞核，Axio Imager M.2显微镜40×放大下每只动物检查三个不同代表性视野，ZEN 3.4软件定量荧光强度。H&E染色使用Morphisto试剂盒，肺损伤评分按Matute-Bello等所述由两名不知分组的研究者独立评分，包括水肿、出血、中性粒细胞浸润和透明膜四项，每张切片选三个代表性区域计算平均评分。统计分析使用GraphPad Prism 10.1.2，鉴于样本量小和生物学变异，采用非参数统计方法，组间比较使用Kruskal-Wallis检验后Dunn多重比较检验，以未治疗CLP小鼠为参照组评估脓毒症条件下的治疗效果，p≤0.05为差异有统计学意义。
结果如下：
全身炎症中CLP动物的选择性MSC介导效应：8 h时，CLP组全身IL-6、KC/CXCL1、MCP1/CCL2和IP-10/CXCL10水平较假手术组升高，未治疗CLP组水平最高，而GM-CSF水平在此早期时间点未显著升高。24 h时，未治疗CLP动物IL-6、KC/CXCL1、MCP1/CCL2或IP-10/CXCL10较假手术组无升高，而GM-CSF水平显著升高；此外，BMMSC治疗动物全身IL-6和MCP1/CCL2水平较假手术组升高。72 h时，IL-6、KC/CXCL1、MCP1/CCL2或IP-10/CXCL10无显著组间差异；GM-CSF是此时间点唯一显示显著差异的介质，未治疗CLP小鼠较假手术组升高，BMMSC或ASC治疗均未显著改变全身GM-CSF水平。BMMSC或ASC给药在任何时间点均未导致相应促炎介质表达水平的统计学显著变化。8 h时MSC治疗组IL-6、KC/CXCL1和MCP1/CCL2均值数值上低于未治疗CLP，但差异未达统计学显著性，鉴于样本量小（n=5）应谨慎解读。
多微生物脓毒症所致肺组织损伤：评估CLP后8、24和72 h肺组织切片并确定各时间点肺损伤评分。CLP后任何时间点（8 h、24 h或72 h）组间肺损伤评分均无统计学显著差异。24 h时CLP组平均肺损伤评分数值上高于假手术组，但差异无统计学意义。72 h时肺损伤评分同样各组间无显著差异。
CLP和MSC治疗后肺组织促炎细胞因子及NLRP3炎症小体表达：8 h时，CLP小鼠
Il1b基因表达较假手术组显著升高，此升高持续至24 h。然而，CLP后8 h或24 h，未治疗CLP小鼠与BMMSC或ASC治疗组之间肺
Il1b mRNA表达无显著差异。72 h时，
Il1b mRNA表达同样在未治疗CLP小鼠与BMMSC或ASC治疗组间无显著差异。与转录数据一致，BMMSC或ASC治疗在任何时间点均未显著改变肺组织IL-1β蛋白水平（定量31 kDa pro-IL-1β条带）。8 h时，所有CLP组
Tnfa mRNA表达均升高，CLP和BMMSC组较假手术组达统计学显著性。24 h时，未治疗CLP小鼠与BMMSC或ASC治疗组间肺
Tnfα mRNA表达无显著差异。与转录发现一致，任何实验组间肺组织TNFα蛋白表达无显著差异。72 h时，
Tnfa mRNA和TNFα蛋白表达在未治疗CLP小鼠与BMMSC或ASC治疗组间均无显著差异。8 h或24 h时，未治疗CLP与假手术动物间肺
Il6 mRNA表达无显著差异；ASC治疗在8 h较未治疗CLP显著降低
Il6 mRNA表达，而BMMSC治疗后变化不显著。24 h时各组间
Il6 mRNA表达无显著差异，所有条件下表达水平总体较低。IL-6蛋白水平组间亦无显著差异。72 h时，BMMSC和ASC治疗小鼠
Il6 mRNA倍数变化较假手术组显著降低，但相对未治疗CLP小鼠无显著差异，表明CLP基础上加用BMMSC或ASC未显著改变肺
Il6表达；蛋白水平上，72 h时在约23 kDa预期分子量处未检测到特异性IL-6条带，IL-6蛋白被认为低于检测限。8 h或24 h时，未治疗CLP与假手术动物间
Nlrp3 mRNA表达无显著差异。8 h时，BMMSC和ASC均较CLP显著降低
Nlrp3 mRNA表达。24 h时，仅ASC治疗CLP小鼠
Nlrp3 mRNA表达较未治疗CLP显著降低，BMMSC治疗无显著差异。与mRNA发现一致，两个时间点CLP与假手术动物间NLRP3蛋白表达无显著差异；然而ASC治疗在24 h较未治疗CLP显著降低NLRP3蛋白表达，BMMSC治疗无显著差异。72 h时，
Nlrp3 mRNA和NLRP3蛋白表达在未治疗CLP小鼠与BMMSC或ASC治疗组间均无显著差异。
CLP和MSC治疗后肺组织补体激活及TLR信号：8 h时，
C3ar mRNA表达在CLP与假手术组间无显著差异；然而ASC治疗较未治疗CLP显著降低
C3ar mRNA表达，BMMSC治疗无显著效应。24 h时各组间
C3ar表达无显著差异。72 h时各组间
C3ar mRNA表达无显著差异。8 h时各组间
C5ar1 mRNA表达无显著差异。24 h时，CLP和BMMSC组
C5ar1 mRNA表达较假手术组显著升高，ASC未诱导显著效应；两个MSC组与CLP组比较均无显著差异。72 h时各组间
C5ar1 mRNA表达无显著差异。关于TLR，8 h时假手术与任何CLP组间
Tlr2 mRNA表达无显著差异，但24 h时未治疗CLP较假手术组显著升高；BMMSC和ASC治疗在任何时间点均未较未治疗CLP显著改变
Tlr2表达。72 h时各组间
Tlr2 mRNA表达无显著差异。此外，8 h或24 h时假手术与CLP组间
Tlr9 mRNA表达无显著差异；然而BMMSC治疗在8 h较未治疗CLP小鼠显著增加
Tlr9表达。72 h时各组间
Tlr9 mRNA表达无显著差异。
多微生物脓毒症小鼠24 h后肺巨噬细胞存在：除细胞因子表达外，巨噬细胞激活和极化参与脓毒症期间肺部炎症反应。为评估CLP和BMMSC或ASC给药后肺组织巨噬细胞相关免疫反应，研究人员分析了CD163（常用作抗炎或消退相关表型巨噬细胞标志物的清道夫受体）的表达。8 h时各组间CD163表达无显著差异。24 h时，未治疗CLP小鼠CD163表达较假手术对照显著升高；BMMSC和ASC治疗在此时间点均未较未治疗CLP显著改变CD163表达。72 h时各组间CD163表达无显著差异。
讨论部分总结：本研究探究了人骨髓来源和脂肪组织来源MSCs在多微生物脓毒症小鼠模型中的免疫调节效应，证明了对肺部炎症反应的轻度、时间依赖性减弱。在更广泛的病理生理背景下，全身炎症在脓毒症相关器官功能障碍特别是ARDS发展中起关键作用。脓毒症诱导的ARDS不仅与IL-6或IL-8等各种促炎介质全身水平升高相关，其水平还与患者死亡率增加相关。相应地，本研究中CLP组小鼠8 h后显示全身IL-6、KC和MCP1水平升高，这与既往体外和临床研究以及小鼠动物研究一致。此外，接受单次静脉给予BMMSCs或ASCs的小鼠在CLP后8 h显示全身IL-6、KC和MCP1水平降低的趋势，这可能表明MSCs在减弱多微生物脓毒症早期全身促炎反应方面具有有益免疫调节效应。然而此模式未持续；24 h时BMMSC治疗小鼠全身IL-6和MCP1水平较假手术小鼠显著升高，而ASC治疗未诱导相当的晚期细胞因子升高。值得注意的是，未治疗CLP小鼠在此时间点这些介质相对假手术对照未显示显著升高。由于全身给药的MSCs已知会快速清除，同时通过与宿主免疫细胞相互作用发挥持久免疫调节效应，BMMSC治疗动物中观察到的晚期细胞因子升高可能反映宿主免疫反应而非直接MSC来源产生。BMMSC和ASC治疗之间的差异时间模式可能提示宿主免疫激活的来源依赖性差异；ASC治疗已在啮齿类动物中显示维持持续抗炎效应长达24 h，在大动物脓毒症模型中长达7天，而来源依赖性差异的机制仍不清楚。除全身炎症外，脓毒症诱导肺损伤的发展以肺部过度局部炎症反应为特征，涉及炎症细胞募集和促炎介质释放，破坏肺泡-毛细血管屏障并促进急性肺损伤和ARDS。为评估局部肺部炎症反应，研究人员首先分析了促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNFα以及模式识别受体（PRR）NLRP3、TLR2和TLR9的表达。与全身数据一致，CLP组8 h后肺
Il1b、
Il6和
Nlrp3 mRNA表达显著增加，而BMMSC和ASC组未增加。既往研究已证明CLP脓毒症期间肺IL-1β和IL-6表达增加及其与肺损伤发展的关联。MSC治疗下促炎细胞因子表达的这些降低与先前报道一致，即小鼠BMMSCs下调CLP小鼠肺
Il6及相关信号通路调节因子包括TNF受体相关因子6（
Traf6）和转录因子c-Jun。然而IL-1β活性主要通过炎症小体依赖性切割在翻译后调节，mRNA表达本身不直接反映生物活性细胞因子水平；因此这些发现应解释为炎症启动的变化而非IL-1β信号活性改变的确定性证据。值得注意的是，研究人员此前使用相同CLP模型进行心脏组织分析的研究中，BMMSCs主要调节补体系统表达而ASCs更强影响
Il6，提示MSC免疫调节效应可能具有器官特异性。BMMSC和ASC给药后8 h观察到的肺
Nlrp3表达降低提示肺组织内先天免疫激活的适度调节。虽然药理学NLRP3抑制已被证明可改善CLP诱导的肺损伤，但MSCs是否对炎症小体激活发挥相当效应仍有待证明。值得注意的是，这些MSC介导的效应是短暂的，未转化为持续结构保护，强调了该模型中MSC免疫调节的有限性和情境依赖性。观察到的肺特异性效应可能与MSC生物分布有关，因为全身给药的MSCs主要滞留在肺中。有趣的是，BMMSC治疗小鼠8 h时肺
Tlr9 mRNA表达较未治疗CLP显著升高，此升高可能反映宿主对降解MSCs的识别，因为细胞碎片可作为DAMPs激活TLR9信号。未治疗CLP小鼠肺
Tlr2表达同样升高，与既往脓毒症肺组织中TLR2上调的报道一致，尽管MSC治疗与未治疗组间无显著差异。脓毒症诱导肺损伤进一步与补体系统即时激活相关。CLP脓毒症期间肺C3a生成和C3aR激活与脓毒症诱导肺损伤发展相关，而C5ar1水平升高与生存受损相关。本研究中，8 h时肺
C3ar mRNA表达在未治疗CLP较假手术动物显示非显著增加；ASC治疗较CLP显著降低
C3ar表达，而BMMSC治疗小鼠显示较低均值表达但未达显著性。这些发现提示ASC对C3a-C3aR轴可能的调节效应，与既往报道一致，即MSC分泌的外泌体通过抑制补体激活减轻急性呼吸衰竭中的免疫失调，且MSCs在缺血/再灌注损伤后降低C5ar1表达。相反，肺
C5ar1表达在未治疗和BMMSC治疗CLP小鼠24 h时均显著升高，两组均未观察到MSC介导的减弱。C3ar和C5ar1调节之间的这种差异可能反映补体级联内不同的激活动力学，因为C5a可通过不依赖经典C3转化酶途径的外源性蛋白酶生成。这些发现提示
C3ar表达可能比
C5ar1对上游免疫调节干预更敏感，且MSC治疗在该模型中仅部分调节补体激活。本研究证明CLP后8 h全身和肺部促炎细胞因子表达升高，MSC给药后特定肺部炎症标志物出现选择性统计学显著降低，而全身细胞因子水平未显著改变。这些发现与提出的MSC免疫调节机制一致，包括巨噬细胞重编程和向表达CD163的抗炎M2型巨噬细胞极化。虽然CD163表达在ASC治疗动物8 h时显示数值增加，但未达统计学显著性；24 h时所有CLP组CD163均升高，限制了MSC特异性效应的解释。需要进一步研究以明确证明该模型中MSC治疗后M1向M2巨噬细胞极化。这些发现应结合若干局限性解读。实验设计未包括可与人类ARDS所用相当的临床症状或功能性肺参数评估。组织学肺损伤和炎症标志物是主要结局指标，组间未观察到结构性肺损伤差异。鉴于该模型相对轻度的肺损伤，替代方法如静脉LPS给药可能更适合诱导稳健的组织学肺损伤。这些考虑反映了研究有意采用的受控机制设计，该研究构思为两种GMP制备MSC来源的探索性头对头比较而非临床治疗模型。解读发现时应牢记三个主要局限性。第一，模型本身转化保真度有限：未控制的CLP手术未使用抗生素或延长液体复苏，MSCs在诱导后立即给药，未评估生理性肺终点；此外假手术组未进行假剖腹术，因此CLP手术的外科成分未被完全控制。这些特征连同异种人MSCs的静脉递送意味着结果应解读为MSC免疫调节的假设生成而非已确立脓毒症相关ARDS治疗疗效的直接证据。第二，免疫调节效应主要为转录水平、幅度适中，72 h时基本消退，mRNA与蛋白数据间一致性有限；特别是NLRP3表达降低不应过度解读，因为炎症小体激活的下游标志物（Caspase-1、IL-18、ASC斑点形成、GSDMD切割）未评估。第三，小组样本量（n=5）限制统计效力，因此无显著差异不应解释为等效性，MSC产品固有的供体间变异性可能促成观察到的变异性。此外CD163免疫荧光信号未按组织面积归一化，鉴于肺泡气腔可变，这可能促成组间信号强度差异。尽管有这些限制，该研究提供了相同条件下骨髓和脂肪来源MSCs的受控、GMP相关比较，并 delineates 特定可测试终点，最显著的是炎症小体加工和后期结构结局，供纳入临床相关支持治疗的充分把握度研究使用。两种MSC类型在早期时间点均选择性降低特定肺部炎症标志物；ASC治疗更一致地达到统计学显著性，而BMMSC效应更多变且某些标志物在晚期时间点升高。这些来源依赖性差异提示不同的免疫调节动力学，可能受时机和炎症环境影响，尽管小样本量限制确定性解释。总体而言，MSC介导的效应在该模型中适度且选择性，强调了MSC免疫调节的情境依赖性而非普遍稳健的抗炎反应。尽管有这些适度效应和上述局限性，MSC给药持续调节肺组织炎症反应，特别是在脓毒症诱导后早期时间点。这些发现支持MSCs在脓毒症相关肺部炎症早期免疫调节中的作用，同时强调未来研究需纳入临床相关功能终点、更大样本量以提高统计效力以及具有更稳健肺损伤的补充动物模型以更好评估转化相关性。
结论部分翻译：在该多微生物脓毒症小鼠模型中，骨髓来源和脂肪组织来源MSCs均发挥了适度的免疫调节效应，但未改善肺损伤评分或全身结局参数。在肺部水平，MSC治疗与炎症小体相关标志物如
Nlrp3表达降低相关，而ASC治疗在早期时间点还额外减弱
Il6表达。然而这些分子效应是时间依赖性的、幅度有限，且未转化为持续全身抗炎反应。总体而言，数据表明MSC治疗在脓毒症中仅赋予部分和情境依赖性免疫调节，在所评估的分子和组织学终点上未证明一种MSC组织来源较另一种具有明显免疫调节优势。
