咖啡酸通过调节嘌呤能信号通路调控高糖诱导的BV-2小胶质细胞炎症反应

《Neurochemical Research》：Caffeic Acid Regulates High Glucose-Induced Inflammatory Responses in BV-2 Microglial Cells: Implications for Purinergic Signaling

　　

高糖诱导的小胶质细胞活化参与糖尿病并发症相关的炎症过程。因此，研究人员探究了咖啡酸（caffeic acid, CA）对高糖刺激的BV-2小胶质细胞炎症反应及嘌呤能信号参数的影响。评估了以下指标：A）氧化应激；b）外核苷三磷酸二磷酸水解酶（Ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase, E-NTPDase）、外-5'-核苷酸酶（Ecto-5'-nucleotidase, E-5'-NT）和腺苷脱氨酶（Adenosine deaminase, ADA）的酶活性；c）P2X7R、A1R和A2AR嘌呤受体的密度；d）炎症标志物（IBA-1、NLRP3和IL-1β）；e）细胞凋亡和细胞周期。与高糖刺激细胞相比，在高糖培养基（GL 25 mM，48 h）暴露的细胞中给予CA（50和75 μM，24 h）处理可提高细胞活力并降低一氧化氮（nitric oxide, NO）、活性物种（reactive species, RS）和硫代巴比妥酸反应物质（thiobarbituric acid reactive substances, TBARS）水平。CA还恢复了ATP和ADP水解并降低了ADA活性。此外，CA增加了A1R密度，同时逆转了高糖诱导的P2X7R和A2AR密度增加。而且，CA处理减弱了高糖培养基中IL-1β密度的增加，而仅CA（75 μM）处理降低了NLRP3和IBA-1密度。此外，该酚类化合物减少了细胞凋亡并通过增加S期和G2/M期细胞比例促进细胞周期进程。总体而言，研究结果表明CA减弱了BV-2小胶质细胞中高糖诱导的炎症和氧化改变，同时调节了嘌呤能酶活性和嘌呤受体密度。这些结果支持嘌呤能信号可能参与CA的细胞效应，并为其在高糖条件下的抗氧化和抗炎作用提供了可能的机制见解。

糖尿病（diabetes mellitus, DM）是一种以高血糖为特征的慢性代谢性疾病，长期可导致严重的损伤和并发症。糖尿病脑病（diabetic encephalopathy, DE）是DM的主要并发症之一，与脑结构和功能损伤相关。脑是高血糖的主要靶器官之一，越来越多的证据表明高血糖水平是DE发生及随后认知障碍的主要相关因素。DE的临床表现包括注意力缺陷、运动障碍、认知和记忆功能障碍、行为紊乱、严重脑血栓形成和卒中。小胶质细胞活化是中枢神经系统（central nervous system, CNS）对有害刺激的基本有益反应；然而在病理条件下，小胶质细胞过度活化可导致脑组织损伤，促进认知障碍和多种神经退行性疾病的发病机制。因此，小胶质细胞活化、氧化应激、细胞因子释放和凋亡被认为是DM相关神经退行性过程的关键特征，这些炎症反应促进DE的进展。基于此，恢复小胶质细胞稳态，尤其是在功能失调状态下，是预防或减缓神经退行性过程进展的有前景的治疗策略。控制小胶质细胞介导的神经炎症反应可能有助于防止进一步的神经元损伤并减缓DE认知缺陷的进展。在嘌呤能系统参与的广泛生物过程中，其在神经炎症和神经退行性机制中的关键作用值得关注。嘌呤能信号通路涉及ATP、ADP、AMP等核苷酸和核苷腺苷（adenosine, Ado），此外还包括P1受体（由Ado激活）和P2受体（主要被ATP和ADP激活，分为P2X和P2Y型）。生物学结果部分取决于这些受体的表达以及配体的细胞外浓度。配体浓度由酶促链调节：首先由外核苷三磷酸二磷酸水解酶（E-NTPDases）将ATP和/或ADP水解为AMP，外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶（E-NPPs）可将ATP直接分解为AMP；AMP随后由外-5'-核苷酸酶（E-5'-NT）水解为Ado；最后Ado被腺苷脱氨酶（ADA）降解为肌苷。特别是，高细胞外ATP浓度作为促炎信号分子可激活P2X7R，其激活与促炎反应、神经退行性变和细胞死亡相关。P2X7R在小胶质细胞中高表达，其激活与小胶质细胞反应性、IL-1β释放和神经炎症相关，且P2X7R刺激被认为是参与NLRP3炎症小体激活的经典途径之一。另一方面，Ado作为ATP酶促降解的主要代谢产物，在CNS中发挥多因素作用，具有抗炎、免疫抑制和神经调节效应，从而有助于神经保护。在已知的四种Ado受体中，A2AR和A2BR与Gs蛋白偶联，可增加细胞内cAMP水平；而A1R和A3R与Gi蛋白偶联，可降低cAMP水平。在Ado代谢型受体中，A1R和A2AR亚型介导Ado在脑中的相关生理和病理作用，一般而言A1R与更神经保护性的特征相关，而A2AR与更神经炎症性的作用相关。为寻找可减轻DM相关神经系统并发症的新辅助疗法，多种利用酚类化合物的治疗策略已成为研究对象。其中，咖啡酸（CA）已被报道具有广泛的药理活性，包括抗氧化、抗炎、降血糖、促胰岛素分泌、抗癌和神经保护作用。此外，研究显示CA对脑损伤、记忆障碍和认知衰退具有治疗潜力。值得注意的是，研究人员此前的研究证明CA可减轻链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）诱导的糖尿病大鼠的氧化应激、神经炎症、嘌呤能和胆碱能功能障碍以及认知障碍，支持其抗DM相关神经退行性变的治疗潜力。基于此前体内DM模型的发现，CA神经保护作用的细胞机制尚不完全清楚。因此，本研究旨在探讨该酚酸对体外暴露于高糖环境的BV-2小胶质细胞氧化炎症反应和嘌呤能信号的影响，以提供可能有助于解释此前体内观察到的神经保护作用的细胞机制见解。需要指出的是，本研究未直接评估神经退行性变，而是聚焦于可能促进神经元损伤和DM相关神经退行性过程的小胶质细胞介导的炎症反应。研究人员开展了以下研究：首先通过浓度效应曲线确定葡萄糖和CA的合适浓度及处理时间，然后在高糖（25 mM，48 h）暴露的BV-2细胞中给予CA（50和75 μM，24 h）处理，评估细胞活力、氧化应激指标（NO、RS、TBARS）、嘌呤能酶活性（E-NTPDase、E-5'-NT、ADA）、嘌呤受体密度（P2X7R、A1R、A2AR）、炎症标志物（IBA-1、NLRP3、IL-1β）以及细胞凋亡和细胞周期。研究得出结论：高糖环境在体外触发BV-2小胶质细胞活化并引起炎症过程；CA处理可减轻小胶质细胞嘌呤能系统组分的变化，并缓解高糖触发的炎症标志物，CA作为辅助治疗策略对脑健康及高血糖相关炎症过程具有前景。本研究的重要意义在于扩展了关于该酚类化合物在高糖挑战条件下效应的认识，并提供了嘌呤能信号可能参与CA细胞效应的证据，为其抗氧化和抗炎作用提供了可能的机制见解。主要关键技术在方法部分概括如下：研究使用小鼠C57BL/6脑源性BV-2小胶质细胞系（购自Rio de Janeiro Cell Bank, BCRJ），采用MTT法评估细胞活力和增殖，使用Griess试剂间接测定NO水平（亚硝酸盐），采用TBARS法评估脂质过氧化，使用DCFH-DA探针测定活性物种（RS）产生，通过无机磷酸释放法测定E-NTPDase（以ATP和ADP为底物）和E-5'-NT（以AMP为底物）活性，通过氨产生间接测定ADA活性，采用Western blot评估P2X7R、A1R、A2AR、NLRP3、IL-1β和IBA-1蛋白密度，使用FITC Annexin V和碘化丙啶（PI）染色试剂盒通过流式细胞术评估细胞凋亡和细胞死亡，通过PI染色流式细胞术进行细胞周期分析，采用Coomassie Blue法测定蛋白含量。研究结果如下：高糖影响微胶质细胞活力、增殖和NO产生——通过葡萄糖浓度曲线（0.5–300 mM，24 h和48 h）结合MTT法和Griess法，发现48 h内25 mM及以下葡萄糖浓度不影响BV-2细胞活力，而50–300 mM显著降低细胞活力；100–300 mM（24 h）和50–200 mM（48 h）增加NO产生；甘露醇渗透压对照未显示显著变化。CA处理BV-2细胞的细胞毒性和氧化代谢指标——通过CA浓度曲线（0.5–300 μM，24 h和48 h）结合MTT法和氧化指标测定，发现24 h内75 μM及以下CA不影响细胞活力，100–300 μM显著降低细胞活力；48 h内75–300 μM显示明显细胞毒性；基于细胞活力和氧化代谢指标结果，选择CA 50和75 μM及24 h处理用于后续实验。高糖挑战并经CA处理的微胶质细胞氧化代谢指标——通过RS和TBARS测定，发现高糖（25 mM）暴露显著增加RS水平约36%，CA（75 μM）单独处理降低RS约40%，CA（50和75 μM）在高糖细胞中分别降低RS约26%和28%；高糖显著增加TBARS水平，CA（50和75 μM）分别降低TBARS约11%和35%。CA调节嘌呤能外切酶活性——通过酶活性测定，发现高糖组E-NTPDase水解ATP和ADP分别降低28%和20%，CA（50和75 μM）分别增加ATP水解32%和36%、ADP水解37%和55%；高糖降低E-5'-NT对AMP的水解65%，CA（50和75 μM）分别增加88%和151%；高糖组ADA活性增加30%，CA（50和75 μM）分别降低12%和17%。CA对高糖暴露BV-2微胶质细胞嘌呤受体密度的影响——通过Western blot，发现高糖增加P2X7R密度64%和A2AR密度62%，降低A1R密度45%；CA（50和75 μM）分别降低P2X7R密度18%和34%，仅CA（75 μM）降低A2AR密度44%并增加A1R密度58%。CA减弱高糖暴露BV-2微胶质细胞的炎症反应——通过Western blot，发现高糖显著增加NLRP3、IL-1β和IBA-1密度分别34%、27%和53%；CA（75 μM）降低NLRP3密度48%，CA（50和75 μM）分别降低IL-1β密度29%和33%，CA（75 μM）降低IBA-1密度58%。CA减弱高糖诱导的细胞死亡并调节微胶质细胞细胞周期——通过流式细胞术结合Annexin V/PI染色和PI染色，发现高糖显著增加晚期凋亡/死亡细胞165%，CA（50和75 μM）分别降低75%和76%；高糖增加G0/G1期细胞群体60%，降低S期和G2/M期细胞群体分别37%和27%；CA（50和75 μM）分别降低G0/G1期29%和23%，仅CA（75 μM）增加S期42%，CA（50和75 μM）分别增加G2/M期27%和28%。讨论部分总结：高血糖诱导的神经炎症反应相关神经退行性变促进DE进展，研究小胶质细胞作为神经炎症的关键调节因子具有重要意义。本研究使用BV-2细胞在体外研究了高糖触发的炎症反应对嘌呤能组分的影响，并展示了CA对这些葡萄糖诱导改变的有益作用。高糖在体外触发氧化应激，CA处理降低这些氧化参数可能归因于其抗氧化能力。嘌呤能信号在CNS中发挥重要作用，其失调与小胶质细胞参与的细胞炎症反应相关。E-NTPDase和E-5'-NT活性功能障碍可能导致细胞外核苷酸代谢改变和ATP增加，ADA活性增加可能有利于Ado降解，影响细胞外Ado可用性。CA处理能够有益地调节嘌呤能酶活性和受体密度的变化。CA对嘌呤能信号的调节可能与其在高糖条件下更广泛的抗氧化和抗炎效应相关，而非通过已证明的直接药理作用。NLRP3炎症小体在IL-1β成熟中发挥重要作用，高浓度细胞外ATP通过结合P2X7R激活NLRP3炎症小体并触发神经炎症过程。CA可能是有前景的减少高糖环境中P2X7R/NLRP3/IL-1β轴介导的炎症反应的药物。高糖创造了对小胶质细胞的细胞毒性环境，最终导致细胞死亡，CA能够减少凋亡性细胞死亡并促进细胞周期进程。研究局限性包括使用BV-2细胞作为永生化小胶质细胞单培养模型，可能与原代小胶质细胞在基因表达、受体谱和功能反应方面存在差异。未来研究需要使用原代小胶质细胞、小胶质细胞-星形胶质细胞共培养系统、类器官模型和体内方法。本研究是此前体内研究的机制随访，旨在探讨高糖暴露的BV-2小胶质细胞是否可重现体内观察到的一些分子改变。研究结论翻译：总之，研究结果表明高糖环境在体外触发小胶质细胞活化，并因此在BV-2细胞中引起炎症过程。总体而言，CA处理减轻了小胶质细胞嘌呤能系统组分的变化，并缓解了高糖水平触发的炎症标志物。这些发现扩展了关于该酚类化合物在高糖挑战条件下效应的认识，使用细胞方法可更直接地提供生物活性分子如CA保护机制的证据。因此，可以提示CA作为辅助治疗策略对脑健康及糖尿病状态下高血糖相关炎症过程具有前景。