基于活性炭耗竭法提升治疗性多肽中和抗体检测药物耐受性的研究

《The AAPS Journal》：Charcoal-Based Depletion Method to Improve Drug Tolerance in Neutralizing Antibody Assays for Therapeutic Peptides

以GLP-1类似物为代表的多肽类治疗药物，在代谢性疾病治疗中正日益成为重要的治疗模式。由于这类治疗药物往往模拟内源性对应物，在临床开发过程中评估其免疫原性，对于理解药物的安全性与有效性特征、满足监管要求均至关重要。本研究描述了一种采用活性炭（activated charcoal）耗竭残余药物并减轻基质干扰的样本预处理策略，从而支持开发具有药物耐受性的中和抗药抗体（neutralizing anti-drug-antibody, nAb）检测方法。该策略以Survodutide（一种处于临床开发阶段的半衰期延长的GLP-1R/GCGR双激动剂）为模型进行优化与验证。优化后的活性炭耗竭策略使检测方法的药物耐受性提升了约100倍，从而能够在临床样本中实现可靠的nAb检测。最终，该方法成功应用于多项经过验证的nAb检测方法中，以支持Survodutide的临床开发。该平台化策略在药物耐受性构成关键挑战的多肽类治疗药物领域，具有广泛应用的潜力。

一、研究背景与现存问题

多肽类生物治疗药物是一类快速扩展的治疗模式，常用于代谢性疾病治疗。与抗体类药物类似，这类药物同样可能诱导患者产生抗药抗体（anti-drug antibodies, ADA）反应。中和抗体（neutralizing anti-drug-antibody, nAb）是ADA中能够结合药物功能区域、阻断其与靶点结合能力的一类抗体亚群，可能导致治疗有效性丧失。尤其值得关注的是，许多多肽治疗药物与内源性蛋白具有高度序列同源性，例如Semaglutide（94%）、Liraglutide（97%）、Exenatide（53%）和Tirzepatide（41%）与GLP-1存在显著相似性，这使得nAb可能交叉中和内源性对应物，带来潜在安全性风险。因此，建立专门且高度特异性的nAb检测方法，是肽类类似物综合临床免疫原性评估策略的重要组成部分。

在nAb检测方法开发中，残余药物和其他干扰成分的存在是主要挑战。常规预处理策略包括亲和捕获洗脱（Affinity Capture Elution, ACE）、生物素-药物提取与酸解离（Biotin-Drug Extraction and Acid Dissociation, BEAD）、固相萃取与酸解离（Solid Phase Extraction and Acid Dissociation, SPEAD）以及靶点辅助药物耗竭等方法。然而，对于Survodutide这类半衰期延长的药物，由于患者样本中残余药物浓度较高，且其分子中引入的脂肪酸链增加了疏水性，可能造成空间位阻效应，上述标准方法均未能达到所需的药物耐受水平，同时保持足够的检测灵敏度。基于临床药代动力学（pharmacokinetics, PK）数据预测，所需药物耐受性约为200 nM，而仅采用最低稀释倍数（Minimum Required Dilution, MRD）1:8时，在5,000 ng/mL阳性对照nAb浓度下的基线药物耐受性仅为5 nM，远不能满足要求。因此，亟需开发一种替代性的样本预处理策略。

二、研究内容与主要结论

研究人员基于活性炭能够从溶液中捕获肽类激素和小分子蛋白的既定能力，开发并优化了一种活性炭耗竭法。该方法通过酸化处理解离样本中ADA与药物形成的免疫复合物，随后加入活性炭浆液以结合并去除游离肽类药物及其他干扰成分，经中和后通过玻璃纤维滤板过滤去除活性炭，最终在基于细胞的检测体系中分析nAb的中和活性。优化后的方法使药物耐受性从MRD单独处理的2.5 nM提升至500 nM（在5,000 ng/mL阳性对照浓度下），提升约200倍，且灵敏度范围为298–414 ng/mL，满足监管要求。该方法成功应用于Survodutide GLP-1R激动、GCGR激动、GLP-1交叉中和及Glucagon交叉中和四项nAb检测方法的验证，药物耐受性均超过预定目标，并成功转移至外部合同研究组织（Contract Research Organization, CRO）实施。此外，该方法对多种长度18–39个氨基酸（3,356–6,940 Da）的代表性多肽均表现出有效的耗竭效果，提示其作为平台化预处理策略的广泛适用性。

三、主要关键技术方法

研究人员在方法开发过程中系统评估了多种预处理策略。BEAD方法通过生物素标记的Survodutide结合链霉亲和素磁珠进行nAb富集，但导致灵敏度显著损失。PEG-8000沉淀法利用抗体与治疗性多肽的分子量差异进行分离，但未达到所需灵敏度。靶点辅助药物耗竭法采用重组人GLP1R-Fc包被板去除游离药物，获得的药物耐受性为7 nM，仍不充分。最终确立的活性炭预处理方法包括：将血清样本与587 mM乙酸按1:1比例混合酸化处理30分钟，加入7.5% w/v活性炭浆液（Sigma Aldrich产品）于1,100 RPM振荡孵育1小时，用1 M Tris-HCl（pH 9.0）中和后经玻璃纤维滤板过滤两次去除活性炭。方法优化中识别出多个关键因素：必须使用宽口移液枪头以保证活性炭的准确分装；活性炭需直接加入样本液面以确保一致性；全程需保持1,100 RPM快速振荡以防止活性炭沉降；玻璃纤维滤板过滤是去除残余活性炭、避免细胞裂解导致信号丢失的关键步骤。肽段耗竭效果通过基于细胞的cAMP检测系统（DiscoverX PathHunter cAMP Detection Kit，使用表达GLP1R或GCGR的CHO-K1细胞系）中的效能曲线偏移以及LC/qTOF-MS完整质量分析（Waters ACQUITY UPLC M-Class系统耦合SCIEX ZenoTOF 7600质谱仪）进行双重确认。样本来源包括BioIVT LLC提供的混合及个体人血清。验证工作在外部CRO完成，评估参数涵盖稳健性、精密度、灵敏度、药物耐受性、基质干扰、稳定性及正常和疾病血清中的检测临界值。

四、研究结果

标准方法提升多肽药物耐受性的测试

研究人员首先评估了MRD、BEAD、PEG沉淀和靶点辅助药物耗竭等常规预处理策略。MRD 1:8单独处理在5,000 ng/mL阳性对照nAb浓度下仅获得5 nM的基线药物耐受性。BEAD预处理导致灵敏度显著损失，无法满足监管预期。PEG-8000沉淀法同样未达到所需灵敏度。靶点辅助药物耗竭法虽为常规方法中效果最佳者，但获得的7 nM药物耐受性仍不足以推进。综上，标准预处理方法均无法实现Survodutide所需的药物耐受且保持灵敏度的检测方法。

活性炭替代方法的开发与优化

基于活性炭捕获肽类激素的能力，研究人员开发了活性炭预处理方法。初始测试显示药物耐受性从5 nM提升至20 nM，但仍未达到200 nM的目标。通过优化过滤工艺等技术环节，确认7.5% w/v为最佳活性炭浓度。优化后的方法在基于细胞的检测中观察到400–3,000倍的EC₅₀偏移，证实了药物的有效去除。该效果在GLP-1、Glucagon和BI-Peptide 517等其他多肽中同样可观察到。LC/qTOF-MS分析确认在高达10,000 nM的生物学相关浓度范围内，Survodutide信号降至基线水平。对六种单克隆抗体和两种多克隆抗体的评估显示，活性炭处理前后中和效率一致，确认该方法不影响样本中nAb的检测。

Survodutide nAb检测方法的活性炭耗竭法验证

优化后的活性炭预处理方法应用于四项nAb检测方法的验证，包括Survodutide GLP1R激动、Survodutide GCGR激动、GLP-1交叉中和及Glucagon交叉中和。四项验证方法的灵敏度范围为298–414 ng/mL，Survodutide nAb检测方法在5,000 ng/mL阳性对照浓度下的药物耐受性为500 nM（2,115 ng/mL），交叉nAb检测方法为100–150 nM（106–624 ng/mL），均超过200 nM的预定目标。验证还纳入了Tirzepatide和Semaglutide的干扰测试，结果显示经活性炭预处理后，Tirzepatide在最高测试浓度500 ng/mL下对GLP1R检测无干扰。

五、讨论与结论

研究人员指出，Survodutide分子中为延长半衰期而设计的脂肪酸链是导致标准预处理方法失效的关键因素：一方面增加了患者血清中的药物暴露和谷浓度，另一方面提高了分子疏水性并可能造成空间位阻，限制了BEAD预处理的性能。活性炭耗竭法通过两个正交方法确认了多肽的有效去除，且不影响抗体的检测。与已发表的GLP-1类似物nAb检测方法相比，该方法在相似阳性对照水平下展现出至少10倍更高的药物耐受性。方法优化中识别的关键因素包括宽口移液枪头的使用、活性炭直接加入液面、1,100 RPM快速振荡保持活性炭悬浮，以及玻璃纤维滤板过滤确保完全去除残余活性炭。

研究结论指出，活性炭样本预处理方法在提升多肽药物耐受性方面被证明是成功且稳健的，产生了经过验证的nAb检测方法以支持Survodutide临床样本分析。该方法能够高效去除血清中的多种多肽，建立在重组胰岛素相关研究的基础上，提示该技术可作为支持其他多肽治疗药物nAb检测的通用平台预处理策略。