5′ tRNA衍生片段tDR-Glu-TTC经ADAR1/自噬/ROS/坏死性凋亡信号轴加重肠缺血/再灌注损伤

《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：A 5′ tRNA-derived fragment tDR-Glu-TTC exacerbates intestinal ischemia/reperfusion injury via ADAR1/autophagy/ROS/necroptosis signaling axis

　　

转运RNA衍生小RNA（tRNA-derived small RNAs，tDRs）是一类功能性小非编码RNA，其中许多由应激条件诱导，并参与组织损伤和疾病发病机制。然而，其在肠缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤中的作用尚不清楚。研究人员利用tDR测序发现，tDR-Glu-TTC在肠组织、血浆、上皮细胞及人类临床样本中显著上调；其水平与肠损伤严重程度正相关。功能上，tDR-Glu-TTC通过激活肠上皮细胞中TNF通路介导的坏死性凋亡（necroptosis）加重肠黏膜损伤。机制上，tDR-Glu-TTC直接结合并抑制RNA编辑酶ADAR1（adenosine deaminases acting on RNA 1，ADAR1），损害自噬相关转录本（ATG18和Lamp2）的腺苷至肌苷（adenosine-to-inosine，A-to-I）编辑。这抑制自噬（autophagy），导致受损线粒体积累和活性氧（reactive oxygen species，ROS）释放。升高的ROS随后促进TNF-α分泌，触发TNF通路介导的坏死性凋亡。此外，增加的ROS下调TRMT6/61A依赖的tRNA-Glu-TTC m¹A（N¹-甲基腺苷）甲基化，增加tDR-Glu-TTC生物发生，形成致病性正反馈环路。因此，使用N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）联合tDR-Glu-TTC-antagomir的双靶点治疗性干预在体内协同减轻I/R诱导的肠损伤。总之，研究人员揭示了tDR-Glu-TTC通过ADAR1/自噬/ROS/坏死性凋亡信号轴加重肠I/R损伤的此前未被认识机制，为对抗肠I/R损伤提供了有前景的治疗策略。

肠缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤通过严重细胞死亡破坏黏膜屏障完整性，可导致全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征，具有较高发病率和死亡率；由于驱动上皮细胞死亡和组织损伤的分子级联复杂，有效治疗策略仍有限。tDRs（tRNA-derived small RNAs，转运RNA衍生小RNA）是在高盐、氧化应激和病毒感染等应激下由核糖核酸酶切割tRNA产生的小非编码RNA，已参与肿瘤、缺血性卒中、神经性疾病及多种组织损伤；但其在肠I/R损伤中的作用尚未明确。ADAR1（adenosine deaminases acting on RNA 1，作用于RNA的腺苷脱氨酶1）介导双链RNA的A-to-I（adenosine-to-inosine，腺苷至肌苷）编辑，参与组织稳态、I/R损伤等，但其在肠I/R中的具体作用和编辑事件不明。自噬（autophagy）可清除受损细胞成分并维持线粒体质量，自噬缺陷加重I/R器官损伤；坏死性凋亡（necroptosis）由RIPK1/RIPK3/MLKL信号轴驱动，自噬与坏死性凋亡在肠上皮中存在交叉调控，但肠I/R中二者互作机制不清。因此，研究人员开展本研究，鉴定tDR-Glu-TTC在肠I/R中上调并与损伤严重程度相关；机制上，tDR-Glu-TTC结合并抑制ADAR1编辑活性，降低ATG18和Lamp2表达，抑制自噬，导致线粒体功能障碍和ROS（reactive oxygen species，活性氧）积累，促进TNF-α分泌并激活TNF通路介导的肠上皮坏死性凋亡；ROS还抑制TRMT6/61A依赖的tRNA-Glu-TTC m¹A（N¹-甲基腺苷）修饰，促进tDR-Glu-TTC生成，形成正反馈环路；NAC（N-acetylcysteine，N-乙酰半胱氨酸）联合tDR-Glu-TTC-antagomir可协同减轻小鼠肠I/R损伤。该研究发表于《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》，为肠I/R损伤提供了新的机制认识和潜在治疗靶点。关键技术方法包括：tDR高通量测序、茎环qRT-PCR、Sanger测序、RNase R消化、小鼠肠I/R模型、体外OGD/R与H/R模型、小肠类器官、HE与Chiu评分、ELISA、FITC-dextran肠通透性、CCK-8/LDH/PI、RNA pull-down联合质谱、RIP、转录组与RNA编辑组分析、RESS-qPCR、m¹A MeRIP-qPCR、多聚核糖体谱、JC-1、Seahorse、ROS检测及agomir/antagomir、sh-ADAR1、R-7050和NAC干预。样本队列来源：15例急诊肠切除肠I/R患者（急性肠系膜动脉栓塞2例、嵌顿疝6例、绞窄性肠梗阻7例）及健康对照血样，取自福州大学附属省立医院主院区和金山院区；动物为C57BL/6小鼠，细胞为Mode-K、Caco-2。研究结果如下：（1）tDR-Glu-TTC在肠I/R损伤中上调并与损伤严重程度正相关：通过tDR测序发现I/R组157个tDRs上调、10个下调；茎环qRT-PCR验证tDR-Glu-TTC在小鼠肠组织、血浆、Mode-K/Caco-2细胞OGD/R模型及患者缺血肠组织中升高，并与Chiu评分、IFABP（intestinal fatty acid-binding protein，肠道脂肪酸结合蛋白）、D-乳酸和AGI（acute gastrointestinal injury，急性胃肠损伤）评分相关。（2）tDR-Glu-TTC在体外和体内加重肠I/R损伤：通过agomir/antagomir及mimic/inhibitor干预，过表达加重黏膜损伤、降低ZO-1和Occludin、增加FITC渗漏及TNF-α/IL-1β，抑制则减轻；细胞和类器官中过表达降低活力、增加LDH释放和PI阳性细胞。（3）tDR-Glu-TTC通过激活TNF通路诱导肠上皮坏死性凋亡促进肠I/R损伤：转录组显示TNF信号和坏死性凋亡通路富集；SPD304、R-7050、Nec-1干预及p-RIPK3/p-MLKL检测表明TNF-α/TNFR轴和坏死性凋亡介导损伤。（4）tDR-Glu-TTC与ADAR1互作激活TNF通路诱导的肠上皮坏死性凋亡：RNA pull-down联合质谱和RIP鉴定ADAR1为结合蛋白；ADAR1敲低加重损伤并取消tDR-Glu-TTC抑制剂的保护作用，ADAR1过表达可逆转tDR-Glu-TTC mimic效应，说明其作用依赖ADAR1。（5）tDR-Glu-TTC抑制ADAR1编辑活性降低自噬相关蛋白ATG18和Lamp2表达：tDR-Glu-TTC不影响ADAR1表达，而结合其脱氨酶结构域；RESS-qPCR和RNA编辑组显示A-to-I编辑下降，ATG18和Lamp2的3′UTR编辑减少；ATG18 mRNA稳定性下降，Lamp2翻译受损，涉及RPL22-RIP、多聚核糖体谱和Igf2bp2结合变化。（6）tDR-Glu-TTC介导的ATG18和Lamp2抑制导致自噬受损和线粒体功能障碍：过表达导致LC3-II降低、p62升高，敲低ATG18和Lamp2可逆转tDR-Glu-TTC抑制剂的促自噬作用；JC-1、Seahorse耗氧率和MitoTracker/LysoTracker共定位显示线粒体膜电位、耗氧能力及线粒体-溶酶体共定位受损。（7）tDR-Glu-TTC诱导线粒体功能障碍升高ROS，促进TNF-α分泌并驱动TNF通路诱导的肠上皮坏死性凋亡：tDR-Glu-TTC过表达升高ROS，NAC降低p-MLKL/p-RIPK3、坏死细胞和TNF信号，并减少TNF-α；患者组织和血浆tDR-Glu-TTC与循环TNF-α正相关。（8）ROS诱导TRMT6/61A依赖的tRNA m¹A低甲基化和肠I/R中tDR-Glu-TTC生成：m¹A MeRIP-qPCR显示I/R和OGD/R下tRNA-Glu-TTC m¹A下降；TRMT6/61A敲低增加tDR-Glu-TTC，Dicer抑制减少其生成；H₂O₂增加、NAC减少tDR-Glu-TTC，NAC逆转m¹A低修饰；患者TRMT6/61A表达下降且与tDR-Glu-TTC负相关；NAC联合tDR-Glu-TTC antagomir较单药更有效。讨论部分总结：该研究将应激诱导的tRNA切割、tDR生成、ADAR1编辑、自噬和坏死性凋亡联系起来，提出ROS抑制TRMT6/61A依赖的tRNA-Glu-TTC m¹A修饰，促进Dicer切割生成tDR-Glu-TTC；tDR-Glu-TTC抑制ADAR1编辑活性，降低ATG18和Lamp2表达，分别影响自噬体形成及自噬体-溶酶体融合，阻断自噬流，导致线粒体功能障碍和ROS积累，形成自放大环路，并促进TNF-α分泌和肠上皮坏死性凋亡。讨论还指出ATG18和Lamp2是ADAR1编辑的功能相关靶点，并承认其他肠细胞类型未探索、ADAR1抑制的确切机制未明、ATG18/Lamp2下调至线粒体功能障碍的分子机制不清、ROS促进TNF-α分泌的确切级联不明、ROS抑制TRMT6/61A的机制未知及antagomir潜在脱靶等局限。结论翻译：总之，研究人员鉴定出tDR-Glu-TTC是一种在肠I/R损伤中上调并具有促损伤特性的tRNA衍生小RNA。机制上，tDR-Glu-TTC结合ADAR1并抑制其活性，损害ATG18和Lamp2转录本的A-to-I编辑，从而破坏自噬。这导致线粒体功能障碍、ROS积累以及随后TNF-α介导的上皮坏死性凋亡。最终，这些事件损害上皮屏障完整性并促进炎症，推动肠I/R损伤病理。此外，研究人员揭示了一个自我放大环路，其中ROS通过TRMT6/61A介导的m¹A低甲基化促进tDR-Glu-TTC生物发生。使用NAC和tDR-Glu-TTC-antagomir双靶向该轴在小鼠肠I/R模型中显示出更优疗效，为减轻肠I/R损伤提供了联合策略。