秘鲁北部马腊尼翁季节性干旱热带森林可可（Theobroma cacao L.）种质Criollo遗传背景的发现及新型高多态性简单序列重复（SSR）标记的开发

《Genetic Resources and Crop Evolution》：New highly polymorphic simple sequence repeat (SSR) markers for cacao genetic diversity research, and the discovery of accessions with Criollo genetic background in the Mara?ón seasonally dry tropical forests of Northern Peru

　　

秘鲁可可（Theobroma cacao L.）具有高度多样性，并以其优良风味特性而闻名。然而，其原生分布范围内的多个地理区域在分子水平上仍未得到充分表征。本研究利用15个简单序列重复（SSR）标记，对来自秘鲁北部和南部（分别对应亚马孙大区与库斯科大区）7个群体的151份可可种质进行了遗传多样性评价，其中6个标记为研究人员利用公开可用的基因组数据自主设计。共检测到175个等位基因，每个位点的等位基因数介于2至25个之间，其中新开发的核SSR标记INDES_mTC98表现出最高的多态性。每份种质均具有独特的多位点基因型，即本研究未发现克隆个体。群体结构分析揭示了4个遗传聚类，分别包含2、13、25和111个个体，共占种内总变异的64.90%，并支持其遗传背景来源于5个祖先群体。值得注意的是，库斯科群体（主要由Chuncho可可样本组成）与亚马孙大区各群体表现出高度的遗传分化，凸显了其独特的遗传组成。Luya群体（由马腊尼翁季节性干旱热带森林保护区内部及其邻近区域采集的样本组成）的连锁平衡模式与过往随机的有性重组事件一致，且未受人类介导的常见无性繁殖（克隆繁殖）影响。利用96个单核苷酸多态性（SNP）标记对Luya种质进行进一步基因分型，结果显示其与中美洲Criollo和Piura Porcelana遗传群体密切相关。这些结果揭示了马腊尼翁季节性干旱热带森林中可可种质存在Criollo相关的遗传亲缘性，且来源于单一祖先群体。观察到的亲缘关系提示秘鲁北部可可群体与Criollo相关种质之间存在历史联系，但其进化历史仍需进一步研究加以阐明。马腊尼翁河沿岸干旱森林区域的有限可达性凸显了该地区作为可可遗传多样性未充分勘探宝库的重要性，对资源保护和育种项目具有重要价值。

论文解读

一、研究背景与问题

可可（Theobroma cacao L.）是原产于南美洲的重要经济作物，具有重要的经济、历史和社会文化价值。考古记录表明，约5300年前，厄瓜多尔和秘鲁上亚马孙地区的Mayo-Chinchipe-Mara?on文化已开始了可可的利用与驯化。秘鲁可可以其优良的风味特性在国际上享有盛誉，其出口价值的75%来自优良风味可可。然而，秘鲁约56%的可可种植面积对应少数栽培品种或种质（如CCN-51），而其余44%为本地原生可可品种。国际需求的增长和新种植园的快速扩张，推动了原生品种的替代和不受控杂交，对秘鲁本地种质的遗传完整性构成直接威胁。

在秘鲁众多可可遗传资源中，亚马孙大区的原生优良风味可可因其独特的感官特性而备受国际市场青睐，并受秘鲁原产地命名规则保护，称为“Cacao Amazonas Perú”。库斯科大区的原生可可被称为Chuncho，以其甜、果香、花香和低苦味的独特感官特征而闻名。然而，尽管亚马孙大区部分地区已有分子水平的研究，但Luya省和Rodríguez de Mendoza省——这两个以生产感官品质卓越但产量极低的可可而闻名的地区——完全未纳入已发表的遗传学研究。特别是Luya省，其可可种群沿马腊尼翁河河岸走廊栽培，位于被称为“马腊尼翁季节性干旱热带森林”的生态系统中，这是一个具有高度植物特有性的生物地理单元，其作为可可祖先栖息地的潜在作用从未被研究。

此外，Criollo在可可驯化历史中具有独特地位。基因组证据表明，Criollo约在3600年前经历了一次单一的驯化事件，导致其遗传基础狭窄并携带较高的有害突变负荷。其分布历来被认为仅限于中美洲和中部美洲。最近在巴拿马可可群体中检测到Criollo祖先成分，提示Criollo相关可可谱系的历史分布和扩散可能比此前认识的更为复杂。因此，在秘鲁亚马孙群体中潜在检测到Criollo祖先成分，将为南美洲Criollo相关可可多样性的进化历史和地理分布提供宝贵见解。

二、研究目标与主要技术方法

本研究旨在利用新开发的SSR标记结合已建立的SSR和SNP标记，对来自秘鲁亚马孙大区和库斯科大区的151份可可种质进行遗传多样性表征，重点关注此前研究不足的区域。具体目标包括：（i）评估151份种质的等位基因多样性和基因型独特性；（ii）确定群体遗传结构和祖先组成；（iii）评估连锁平衡模式作为随机有性重组的指标；（iv）通过SNP基因分型将Luya种质归属到已知遗传群体。

研究采用的主要关键技术方法包括：基于两个公开可可基因组（Criollo遗传群体的B97-61/B2和Amelonado群体的Matina 1-6）利用QDD 3.1程序进行SSR标记的计算机模拟设计，并通过BLASTN 2.8.1+程序验证引物在两基因组中的存在；采用Schuelke（2000）方案进行PCR扩增和荧光标记，通过ABI 3730XL分析仪进行毛细管电泳和片段分析；利用R软件中poppr包进行遗传多样性分析；利用LEA包进行群体结构分析（基于交叉熵准则确定最优K值）；利用关联指数（I_A）和标准化关联指数（r?d）进行连锁不平衡评估；对Luya群体12份种质利用96个SNP标记在Fluidigm 96.96 Dynamic Array?平台进行基因分型，并与国际可可种质数据库的20份参考种质（包括CRIOLLO 13、CATONGO、ICS 1、POUND 7/C、CCN 51、PA 169、PA 310、RB 41及Piura Porcelana种质）进行PCoA比较分析。

三、主要研究结果

SSR标记与等位基因多态性。 研究人员从41个SSR位点中筛选出15个标记用于最终分析，其中9个为Motamayor等（2008）报道的同源标记，6个为新开发的标记（INDES_mTC90、INDES_mTC93、INDES_mTC98、INDES_mTC107、INDES_mTC113和INDES_mTC125），包括1个叶绿体标记。共检测到175个等位基因，每个位点等位基因数介于2至25个。新开发标记的平均等位基因数（17.50）显著高于同源标记（7.78），并在Simpson指数（λ=0.76）、期望杂合度（H_exp=0.76）和均匀度（0.68）等遗传多样性参数上均高于同源标记（λ=0.58，H_exp=0.59，均匀度=0.62）。

遗传多样性。 151份种质均具有独特的多位点基因型（MLG），表明每份种质在遗传上均独一无二。总体Shannon-Wiener指数（H）为5.02，Stoddart-Taylor指数（G）为151，Simpson指数（λ）为0.993。群体层面，Utcubamba多样性最高（H=3.78，G=44，λ=0.977），Bagua最低（H=2.20，G=9，λ=0.889）。总体期望杂合度（H_exp）为0.656，观测杂合度（H_o）为0.439，所有群体的观测杂合度均低于期望杂合度。所有群体的均匀度指数（E₅）均为1，表明基因型分布完全均匀。

群体结构。 基于LEA包的交叉熵准则，151份种质最优表示为5个祖先遗传组分（K=5）。Condorcanqui和Utcubamba表现出最高的混合水平，而Luya种质显示出单一祖先组分（K₅）的主导贡献。UPGMA树状图揭示了4个不同聚类：Group I包含2份来自Condorcanqui的种质；Group II包含13份库斯科群体种质；Group III包含25份来自5个群体的种质，其中包括3份被农民认定为CCN-51的种质；Group IV包含111份种质（占总样本的73.51%），来自6个群体，表明这些群体间具有较高程度的遗传同质性。PCoA前两个主成分解释了总遗传变异的43.04%（PCoA1为31.26%，PCoA2为11.78%）。

群体间遗传分化。 AMOVA分析显示，群体间（16.11%）、群体内样本间（18.99%）和样本内（64.90%）所有方差组分均显著（p<0.05），Phi统计量分别为0.35（总样本）、0.23（群体内样本）和0.16（群体间）。G_st固定指数显示，Cusco与Luya（G_st=0.87）和Cusco与Rodríguez de Mendoza（G_st=0.83）之间的分化值最高，而Utcubamba与Bagua之间分化最低（G_st=0.06）。

连锁不平衡。 总体关联指数（I_A）为2.893，标准化关联指数（r?d）为0.213，均高度显著（p=0.000999）。群体层面，Condorcanqui、Chachapoyas、Rodríguez de Mendoza、Bagua、Utcubamba和Cusco均表现出显著的连锁不平衡（p=0.000999），与无性繁殖（克隆繁殖）一致。相反，Luya群体的分析结果不显著（p=0.74），表明存在连锁平衡，提示该地区基因型可能源于有性繁殖事件。

基于SNP的主坐标分析。 12份Luya种质中3份（TCL-3、TCL-4和TCL-8）因基因分型失败被排除，剩余9份用于分析（平均检出率98.38%）。这些种质被分为两个遗传聚类：第一聚类与Criollo遗传群体相关，包括TCL-9、TCL-10、TCL-11和TCL-12；第二聚类与Piura Porcelana群体相关，包括TCL-1、TCL-2、TCL-5、TCL-6和TCL-7。PCoA第一轴解释了50.21%的遗传变异，第二轴解释31.21%，第三轴解释7.81%。

四、讨论与结论

本研究中新开发的SSR标记表现出比传统同源标记更高的多态性和遗传多样性参数，验证了基于公开基因组进行计算机模拟设计SSR标记的有效性。Saunders等（2004）曾建立15个SSR标记作为可可DNA指纹分析的国际分子标准，但这些标记设计于完整可可基因组发布之前，而本研究基于全基因组信息开发的新标记具有更高的多态性，为可可遗传多样性研究提供了更有效的工具。

Luya群体表现出独特的SSR遗传特征，其连锁平衡模式提示该群体可能源于随机的有性重组事件，而非人类介导的克隆繁殖。进一步SNP分析显示，Luya种质与中美洲Criollo和Piura Porcelana遗传群体密切相关，且来源于单一祖先群体。这一发现揭示了马腊尼翁季节性干旱热带森林中可可种质存在Criollo相关的遗传亲缘性，提示秘鲁北部可可群体与Criollo相关种质之间存在历史联系。考虑到Criollo的分布历来被认为仅限于中美洲和中部美洲，这一发现为理解Criollo相关可可谱系在南美洲的进化历史和地理分布提供了新的视角，尽管其进化历史仍需进一步研究加以阐明。

本研究结论指出，马腊尼翁河沿岸干旱森林区域的有限可达性凸显了该地区作为可可遗传多样性未充分勘探宝库的重要性。这些结果揭示了秘鲁亚马孙大区与库斯科大区可可群体间存在显著的遗传结构差异，其中库斯科群体（主要由Chuncho可可组成）与亚马孙大区各群体表现出高度遗传分化。本研究为秘鲁本地可可遗传资源的保护和战略性利用提供了框架，对该区域可可种质的保护与育种项目具有重要价值。