《Plant Molecular Biology》：Advances in the transcriptional regulation of seed vigor and its application in molecular breeding for rice
水稻种子活力（seed vigor）是一个生命周期性状，其播种后的表现取决于种子发育过程中建立的、贮藏期间得以保持的、以及在萌发和成苗过程中被重新激活的生理能力。转录网络并非作为孤立的阶段特异性通路发挥作用，而是协调保护与生长之间的一系列转换。在种子发育过程中，转录因子（transcription factors, TFs）建立胚胎发育能力、贮藏物质组织、耐脱水性和蛋白质稳态（proteostasis），从而为后续表现创造生理能力。在贮藏期间，ABA和生长素相关的bZIP网络，包括OsARF12–OsbZIP23和OsbZIP23–PER1A模块以及SAG9相关调控，通过抗氧化和保护过程维持种子寿命（longevity）；新兴的水杨酸（salicylic acid, SA）相关信号进一步拓展了这一激素–氧化还原调控框架。在吸胀之后，ABA–GA平衡、糖和能量信号、贮藏物质动员、活性氧（reactive oxygen species, ROS）稳态以及细胞扩张决定萌发的时间性和整齐度，而相关调控模块支持在盐害、低温、水分亏缺和缺氧条件下的成苗。重要的是，现有证据在强度上差异显著：部分调控因子直接得到萌发、寿命、休眠或逆境活力表型的支持，而其他因子仍主要是从籽粒组成或种子发育性状推断的发育候选因子。田间出苗验证和自然贮藏证据也仍然有限。因此，研究人员提出水稻种子活力的改良应优先考虑阶段适宜的调控等位基因和转录因子活性的精准调节，同时综合考虑耐贮藏性、休眠与穗发芽（pre-harvest sprouting, PHS）抗性、田间成苗、产量和稻米品质。
**引言**
种子活力（seed vigor）描述的是一个种子批（seed lot）快速且整齐萌发、耐受不利条件并支持健壮成苗的能力。它与生活力（viability）相关但有区别：生活力是在适宜条件下萌发的能力；休眠（dormancy）阻止一个本来有生活力的种子萌发；而寿命（longevity）描述贮藏期间生活力和表现的保持。因此，一个种子批可能保持较高的最终萌发率，同时逐渐丧失萌发速度、整齐度、逆境耐受性和田间出苗能力。较强的休眠可以降低穗发芽（PHS），但也可能延迟播种后的萌发和成苗。因此，活力最好不被理解为单一分数，而是作为一个表现轨迹——在收获前建立、在贮藏期间维持或受损、在萌发和成苗期间表达。相应地，种子活力应作为跨越阶段的性状来评价，而非单次萌发试验的结果。
这一生命周期视角对直播稻尤为重要，因为播种后种子表现直接影响作物成苗。直接播入糊泥土壤、干土或积水中的种子可能遭遇低温、盐害、瞬时水分亏缺、缺氧、土壤板结、播种深度不一和杂草竞争。快速出苗缩短了幼苗完全依赖种子贮藏物质的时期并改善早期冠层建成，但选择快速萌发可能削弱在温暖潮湿收获条件下防止PHS所需的休眠。因此，直播性能的改良需要协调种子成熟和贮藏期间建立的保护过程与播种后萌发的及时激活。育种挑战不仅是加速萌发，而是实现从收获前保护到播种后生长的适当转换。
实现从收获前保护到播种后生长的转换需要能够根据发育阶段、组织背景和环境条件改变其输出的转录调控因子。这种灵活性不仅由转录本丰度变化产生，还通过伙伴选择、磷酸化、细胞内定位和蛋白质周转产生。因此，同一调控系统可以在种子生命周期的连续阶段贡献不同的生理输出。激素和能量响应型转录因子将发育信号与LEA积累和抗氧化防御等保护过程联系起来，也与后续萌发过程中的贮藏物质合成、α-淀粉酶产生、代谢物运输和细胞扩张联系起来。ABA响应型bZIP因子提供了一个特别清晰的例子：其活性受SAPK/SnRK2依赖的磷酸化、选择性二聚化和蛋白质水解调节，使ABA响应转录得以调整而非简单地开启或关闭。因此，核心问题不是哪个转录因子家族在特定阶段发挥作用，而是多个调控家族——包括B3/VP1、AP2/ERF、bHLH、NAC、WRKY、Dof、NF-Y、MADS-box、BZR、热激因子和bZIP——如何被时间协调以将种子从发育保护转向代谢再激活和生长。种子活力因此源于多个转录因子家族之间的协调调控，而非单一主导调控因子的作用。
这些转录调控因子随着种子从发育到成苗的进程依次运作。在灌浆和成熟期间，它们调控胚胎发育、贮藏物质沉积、营养运输、细胞保护和耐脱水性的获得，从而建立成熟种子的生理能力。在贮藏期间，这一能力受到氧化损伤逐渐积累、蛋白质劣化和膜不稳定的挑战。在吸胀之后，转录调控转向激素再平衡、贮藏物质动员、线粒体恢复、受控的活性氧产生、细胞壁松弛和胚胎生长。因此，主要调控需求从播种前建立和保持种子能力转变为播种后适当时机激活生长。
尽管种子发育、贮藏、萌发和成苗可以分别研究，但其调控后果跨越阶段边界。籽粒发育期间引入的变化可能在新鲜收获的种子中检测不到，仅在贮藏后或逆境萌发条件下才显现。相反，改善成熟或贮藏存活性的保护程序如果在吸胀后未及时减弱，可能延迟萌发。水稻种子活力因此反映了从种子发育到成苗的转录调控的连续性和时间性，而非单一发育阶段单一通路的活性。这一时间协调，连同收获前保护与播种后快速生长之间的平衡，总结于图1。这一生命周期框架为以下各节考察转录因子网络如何建立、保持并最终表达水稻种子活力提供了基础。
**复合种子活力性状的证据界定**
**水稻种子活力的定义、组分和表型鉴定**
水稻种子活力通过种子批快速且整齐萌发、贮藏后保持表现、以及在有利和不利条件下支持早期幼苗生长和成苗的能力来表达。由于这些表现发生在不同阶段并受部分不同的生理过程支配，种子活力应使用萌发动力学、幼苗生长、耐贮藏性、逆境响应和田间出苗的互补测量来表征，而非单一指标。因此，种子活力应作为复合的、跨越阶段的性状来评价，而非由单一测量所代表的结果。
相应地，两个最终萌发率相似的种子批在萌发速度、同步性、逆境后恢复和田间出苗方面仍可能差异显著。最终萌发率主要反映生活力，因此在评价种子活力时应辅以萌发动力学、幼苗生长、逆境恢复和出苗测量。有用的动力学性状包括达到10%和50%萌发的时间、平均萌发时间、萌发指数、速度系数和同步性。形态学输出包括胚根和胚芽鞘长度、干重、根冠分配以及结合萌发和幼苗生长的活力指数。逆境试验应明确温度、渗透势、盐浓度、氧气可用性、播种深度和基质。贮藏研究应包括控制劣变或加速老化，但当辅以自然贮藏或高氧方案时结论更为有力，因为老化方案产生重叠但不完全相同的损伤谱。
对于直播稻，田间出苗代表最具农艺相关性的终点，尽管其与分子和生理分析的整合频率较低。实验室试验可以可重复地对种子批进行排序，但可能无法捕捉土壤阻力、微生物暴露、可变水膜或杂草竞争。为避免高估转化相关性，本综述区分四个验证情境：实验室萌发试验、控制逆境试验、控制环境条件下的土壤成苗、以及实际田间条件下的重复出苗。在生长箱或控制设施中播种土壤比培养皿萌发提供更大的生态真实性，但不被视为等同于田间验证。因此，直播稻相关性的最强证据将分子功能和萌发动力学与逆境恢复、土壤成苗以及最终重复田间出苗联系起来。PHS应在控制湿度或模拟降雨条件下对完整穗进行评价，而非从人工收获干种子的萌发推断。因此，田间出苗和完整穗试验应用于验证实验室表型是否转化为农艺相关的种子表现。以下使用这一证据层级来区分机制明确的调控因子与在直播稻中农艺表现尚待证明的调控因子。
种子活力不应作为生活力、休眠、寿命或早期幼苗活力的同义词使用。生活力是在有利条件下萌发的能力；休眠是 otherwise viable 种子中萌发的可逆阻断；寿命是贮藏期间保持表现的持续时间；早期幼苗活力描述萌发后的生长。因此，一个种子批可能保持高生活力但丧失出苗速度，具有强休眠但耐贮藏性好，或快速萌发但在逆境下成苗差。区分这些相关性状对于将分子调控因子归因于实验表型所支持的种子表现特定组分是必要的。
**转录因子功能的生理基础和证据标准**
转录调控通过明确的生理过程而非仅通过转录本变化影响种子活力。因此，一个有用的因果框架是：转录因子或调控状态 → 分子靶标 → 生理过程 → 可测量的活力表型。在种子发育期间，调控网络建立胚胎发育能力、贮藏物质组织、耐脱水性和保护能力；在贮藏期间，这些能力必须通过氧化还原稳态、膜和蛋白质稳定性以及修复来保持；在吸胀之后，激素重置、贮藏物质动员、能量产生、ROS稳态和细胞扩张决定萌发的速度和整齐度；在早期成苗期间，同样的过程必须在环境逆境下保持功能。因此，将分子调控与活力联系起来的生理过程因阶段而异，但形成从种子形成到成苗的连续轨迹。
水稻的实验研究提供了这些生理过程与可测量种子活力组分之间的直接联系。在种子发育期间，OsHSFC1b依赖的热激和棉子糖家族寡糖途径与种子重量、大小和后续活力的增加相关，而异天冬氨酰损伤在贮藏期间损害这一保护功能。在老化期间，氧化还原稳态和抗氧化能力的破坏伴随种子寿命和贮藏后萌发表现的降低。在吸胀之后，ABA–GA动态影响休眠释放，而SnRK1A依赖的糖信号支持贮藏物质动员、萌发和早期幼苗生长。在盐胁迫下，OsbHLH035差异性地影响处理期间的萌发和逆境解除后的生长恢复，表明萌发和逆境后恢复代表逆境活力的不同生理组分。总之，这些例子表明，生理层面在与活力变化的特定组分（如耐贮藏性、休眠释放、萌发表现或逆境后恢复）相联系时最具信息量，而非被视为分子调控与表型之间的一般中间层。
在这一生理框架内，转录因子功能的证据不仅应确定调控因子在何处何时发挥作用，还应确定其分子输出如何改变与种子表现相关的生理过程。由于种子活力在多个组织和发育阶段表达，转录因子功能的证据必须在空间和时间上加以解析。全颖果分析可能掩盖组织特异性调控，因为胚胎、盾片、糊粉层和淀粉质胚乳执行不同功能并依赖不同的转录因子复合物。bulk颖果RNA可能掩盖相反的细胞类型响应，也可能仅因组织比例不同而变化。在干种子、早期吸胀、种皮破裂、胚根突出和萌发后阶段取样比单一晚期时间点更具信息量。在已知转录因子受翻译后调控的情况下，蛋白质丰度应辅以磷酸化、定位或周转测量。因此，当调控因子、分子靶标、生理输出、组织和发育背景以及所测种子活力表型能在同一因果框架内联系时，机制解释最为有力。
表1总结了水稻种子活力主要组分的操作定义、推荐测量、主要混杂因素和解释标准。将转录因子与种子活力联系起来的证据因所检查的发育阶段、所测表型和可用的实验验证类型而异。仅限于籽粒发育或籽粒组成的研究为可能影响后续种子表现的发育过程提供证据，但不独立确立在种子活力中的直接作用。在标准条件下萌发动力学或早期幼苗生长的可测量变化最有力地支持直接参与萌发，而参与逆境活力还需要在明确界定的逆境下评价，并在适当情况下测量逆境后恢复或幼苗成苗。根据这些标准分类将所提出的分子机制与可用证据支持的特定活力组分和农艺表型联系起来。这些标准防止发育、组成或营养逆境表型被自动解释为种子活力调控的直接证据。
**文献检索、范围和综述框架**
基于上述表型和证据标准，本综述考虑种子生命周期连续阶段的种子活力相关表型，包括籽粒发育和成熟、贮藏、休眠释放、萌发和幼苗成苗。遗传和表型研究表明种子表现的不同组分可以在不同阶段和不同环境条件下表达，包括休眠和穗发芽研究、贮藏后萌发能力的QTL定位以及温度依赖性幼苗活力的QTL定位。这些遗传和表型研究识别与种子表现相关的变异，但本身不确立转录调控机制。
因此，本综述的转录组分基于调控因子及其下游功能的直接遗传和分子证据单独评价。重点放在bZIP、B3、AP2/ERF、bHLH、NAC、WRKY、Dof、NF-Y和MADS-box家族以及与种子发育、耐贮藏性、休眠、萌发和逆境适应相关的调控模块上。耐贮藏性和休眠的遗传分析，包括SAG9相关变异和种子寿命QTL，进一步说明性状相关遗传位点与直接验证的转录机制之间的区别。单个转录因子的遗传和分子研究揭示了调控蛋白如何在种子发育期间控制胚胎成熟、贮藏物质沉积、母体组织重塑、蛋白质稳态和耐脱水性。这些发育过程建立成熟种子的生理和代谢能力，从而影响其在贮藏、萌发和早期成苗期间的后续表现。在贮藏和向萌发过渡期间，转录网络进一步调控抗劣化性、休眠维持、贮藏物质动员和胚胎生长的及时恢复。沿种子生命周期组织这些机制区分了收获前建立活力的过程与收获后保持或表达活力的过程。最直接的机制证据由结合突变体或过表达表型与启动子结合、转录激活、蛋白质互作或遗传分析的研究提供。这些互补方法的汇聚为将转录因子与种子活力特定组分联系起来提供了比任何单一证据类型更强的基?础。多组学分析可以识别调控网络和候选因子，但由此产生的关联需要进一步的遗传和分子验证才能建立完整的因果通路。因此，主要通过籽粒组成或营养逆境响应表征的转录因子在其所调控的生理过程方面讨论，而其在水稻种子活力中的直接作用仍有待实验确立。这一区分将充分支持的种子活力机制与仍需要在种子中直接验证的生物学上合理的关系分开（表2）。
**籽粒发育期间种子活力的转录调控**
**胚胎成熟与耐脱水性的获得**
种子发育建立后续种子活力表达的生理能力。发育中的颖果必须产生有能力的胚胎、适当组织的胚乳、保护性分子和耐脱水的细胞状态。这些发育过程决定成熟种子的生理和代谢能力，从而影响其在贮藏、萌发和幼苗成苗期间的后续表现。图2总结了建立这一生理基础的相关发育过程，包括胚胎成熟、母体组织重塑、糖运输和灌浆、贮藏物质合成和质量、内质网蛋白质稳态以及发育相关调控通路。总之，这些过程影响贮藏物质可用性、胚胎发育能力、细胞保护以及可能影响后续种子表现的蛋白质和膜稳定性。因此，籽粒发育为后续种子活力奠定生理基础，但仅发育表型不能确立在活力调控中的直接作用。
在胚胎中，VP1–ABA响应型bZIP模块代表一个特征明确的控制成熟相关转录的调控系统。水稻VP1（OsVP1），玉米VIVIPAROUS1和拟南芥ABI3的直系同源物，与ABA响应型bZIP蛋白如TRAB1合作激活成熟相关转录。TRAB1结合ABREs并与VP1互作，而ABA激活的SAPK/SnRK2激酶磷酸化TRAB1和相关bZIPs以提高转录活性。总之，这些相互作用将上升的ABA转化为以LEA积累、耐脱水性和抑制提前萌发为特征的协调保护状态。重要的是，OsVP1在成熟后而非仅在种子发育期间发挥作用。OsVP1随后激活Sdr4并参与成熟后休眠控制，提供了同一转录因子在种子生命周期连续阶段运作的直接例子。OsVP1（水稻ABI3直系同源物）的时空表达模式与这一成熟角色一致。其他ABA响应型bZIPs，包括OsABI5，参与水稻ABA和逆境响应，尽管跨越完整种子活力连续体的直接证据仍然有限。豆科研究进一步支持ABI5型bZIPs在种子成熟和寿命中的保守作用。因此，VP1–bZIP模块说明保护发育中胚胎的转录程序如何也能影响休眠和播种后表现。
**胚乳贮藏物质沉积与组合调控**
在胚乳中，OsbZIP58（又称RISBZ1或OsSMF1）是贮藏物质沉积的主要调控因子。OsbZIP58结合淀粉生物合成基因的启动子，包括OsAGPL3、Wx、OsSSIIa、SBE1、OsBEIIb和ISA2，突变体改变直链淀粉含量、支链淀粉链分布和胚乳形态。OsbZIP58（OsSMF1）的全基因组分析进一步将该因子与贮藏蛋白和灌浆程序联系起来。OsbZIP58（RISBZ1）识别GCN4样基序，而Dof因子RPBF识别醇溶蛋白框。这两个因子在种子贮藏蛋白启动子上既冗余又协同作用，提供了启动子语法和组合控制的经典例子。当前研究清楚地确立了OsbZIP58在调控胚乳贮藏物质组成中的作用。其对种子活力的更广泛贡献可能通过种子老化、萌发动力学和田间出苗的分析进一步阐明。
**母体营养供应、种子大小和灌浆速率**
除胚乳内贮藏物质合成外，有效灌浆依赖介导营养向发育种子转移的母体组织的及时重塑。OsMADS29控制珠心珠心突起的程序性细胞死亡，扰动其表达破坏母体组织退化、激素稳态、胚胎发育和胚乳灌浆。上述发育调控因子对种子活力并不都具有相同的证据权重。例如，OsMADS29在母体组织重塑和胚–胚乳协调中的既定功能提供了可能影响后续种子表现的合理发育途径，但直接活力表型仍然有限。因此，OsMADS29目前应被视为发育候选因子而非直接确立的种子活力调控因子。相反，若干调控因子将发育过程与可测量的发育后种子表现联系起来，因此为发育对活力的贡献提供了更强的证据。
OsHSFC1b提供了这些阶段之间最清晰的机制桥梁。它通过热激和棉子糖家族寡糖途径促进种子重量、大小和活力，而贮藏期间的异天冬氨酰修饰损害其活性，直接将发育保护与后续蛋白质损伤和老化联系起来。OsSV5提供了一个互补的遗传学例子：从种子活力QTL中鉴定，连同功能和单倍型证据，将自然调控变异与种子表现差异联系起来。这些遗传控制的效应进一步受种子生产环境制约，因为灌浆期间的温度改变淀粉积累和结构，并伴随后续活力的相应差异。总之，这些发现表明发育对种子活力的贡献由调控基因型、灌浆期间建立的生理状态以及该状态形成的环境之间的相互作用决定。
OsbHLH001–OsTPS8模块特别具有信息量，因为单一启动子变异将垩白、海藻糖-6-磷酸信号、α-淀粉酶调控和种子活力跨籼稻和粳稻背景联系起来。与敲除不同，该等位基因改变调控幅度而保持蛋白质完整，使其成为精准育种的现实模型。OsTPS8相关的种子活力差异得到萌发试验、多样遗传背景和控制环境条件下土壤成苗评价的支持。然而，这些实验不构成重复田间出苗试验。因此，OsTPS8启动子变异为活力调控提供了强的遗传和机制证据，但其在实际直播稻田间环境下的稳定性和育种价值仍有待确立。这一区分很重要，因为在控制条件下加速萌发的等位基因未必能在异质土壤和多逆境田间条件下改善成苗。
发育转录因子以两种主要方式贡献种子活力。一些已直接与老化、萌发或成苗联系起来，而另一些塑造胚胎、贮藏物质系统、营养供应或蛋白质稳态，后续表现依赖于此。
**需要直接种子活力验证的潜在发育调控位点**
若干转录调控因子强烈影响籽粒发育、贮藏物质组成、营养运输或蛋白质稳态，但目前缺乏发育后种子活力的直接表型证据。这些因子仍然相关，因为它们塑造成熟种子继承的生理状态；然而，在其对萌发、寿命、逆境恢复或幼苗成苗的效应被证明之前，其发育功能不应被解释为直接的种子活力调控。
RSR1代表这一类发育候选因子。RSR1抑制广泛的胚乳淀粉合成基因，RSR1功能丧失改变粒重、直链淀粉含量、支链淀粉结构和糊化行为。这些淀粉结构变化可能影响吸胀后贮藏物质动员，但RSR1等位基因对萌发动力学、耐贮藏性、逆境恢复或幼苗成苗的直接效应尚未被证明。因此，RSR1目前应被视为潜在的发育调控位点而非已确立的种子活力调控因子。
类似的证据边界适用于OsNF-YB1–OsNF-YC12–bHLH144调控网络。OsNF-YB1在糊粉层中富集，直接促进蔗糖转运蛋白表达并促进同化物向胚乳装载。全基因组结合和互作研究将其作用扩展到参与运输、灌浆和胚乳发育的基因。OsNF-YC12贡献贮藏蛋白积累和粒重，NF-YB1-NF-YC12-bHLH144复合物直接激活Wx，将组合转录因子组装与直链淀粉合成联系起来。这一例子突出了组合转录因子复合物在协调蔗糖运输、直链淀粉合成和胚乳发育中的重要性。该模块表明胚乳贮藏物质组成由营养输送和生物合成的协调控制决定，而非任一过程单独作用。
OsbZIP60/OPAQUE3提供另一个合理但目前间接的发育联系。OsbZIP60调控发育胚乳中的内质网未折叠蛋白响应、伴侣蛋白表达、蛋白体形成、淀粉积累和贮藏蛋白沉积。这些蛋白质稳态功能可能影响后续种子表现，但归因于OsbZIP60的直接寿命、萌发或成苗表型尚未确立。因此，其当前证据支持在胚乳蛋白质稳态和籽粒形成中的既定作用，而其对种子活力的贡献仍是候选关系。
**贮藏期间保持活力**
**种子老化过程中的氧化损伤和氧化还原阈值**
干种子代谢静止但化学活跃。脂质过氧化、蛋白质羰基化、异天冬氨酰形成、核酸损伤、膜相变和非酶反应以由基因型、水分、氧气和温度决定的速率积累。这些损伤在干贮藏期间可能表型沉默，仅在吸胀后当受损的膜、线粒体和修复系统无法有效恢复代谢时才显现。种子劣化常遵循阈值样模式：分子损伤在干贮藏期间积累，但仅在吸胀后膜、线粒体和修复系统被重新激活时才表型显现（图3）。经典QTL分析确立了水稻种子寿命和贮藏后萌发的显著自然变异。因此，种子寿命应被视为在代谢和细胞修复被重新激活之前将累积损伤保持在功能阈值以下的能力。
**以bZIP为中心的解毒和保护网络**
在保持种子发育期间建立的生理能力的通路中，OsbZIP23–PER1A模块为贮藏存活的转录控制提供了特别强的机制证据。对老化耐受性 contrasting 品种的多组学比较将OsbZIP23鉴定为调控枢纽。过表达株系在加速老化后萌发改善，而敲除株系表现降低。OsbZIP23直接结合PER1A启动子的含ABRE区域并激活该1-Cys过氧化物还原酶；遗传分析将PER1A置于OsbZIP23下游。通过将ABA相关转录与过氧化物解毒联系起来，该通路解释了贮藏种子如何保持代谢重启的能力。然而，所报道的活力表型主要通过加速老化和控制萌发试验评价，未包括土壤或重复田间出苗验证。因此，OsbZIP23–PER1A模块在老化耐受性方面机制明确，而其在对直播稻条件下田间成苗的贡献仍有待测试（表3）。
上游激素信号进一步调控OsbZIP23–PER1A保护通路的强度。生长素信号通过OsARF12增加OsbZIP23转录，而SAPK1介导的磷酸化增强OsbZIP23蛋白与ABA信号相关的活性。OsTIR1-OsIAA10-OsARF12生长素通路和SAPK1-bZIP23 ABA相关通路因此汇聚于改善种子活力的调控轴。从育种角度看，这一双重调控指向上游信号组分和蛋白质状态控制位点作为有用变异的可能来源，而非将等位基因发现限于OsbZIP23编码区。因此，调控幅度和蛋白质激活的变异可能比完全改变OsbZIP23功能提供对贮藏保护的更大控制。
第二个寿命分支由SEED-AGING GENE 9（SAG9）基因控制。核SAG9蛋白负调控耐贮藏性并对休眠有中等效应，通过与若干种子表达的class-E bZIP蛋白（包括ABI5/bZIP10、bZIP23、bZIP40、bZIP46、bZIP66/TRAB1和bZIP72）互作并部分抑制其对保护性靶标（如EM1、LEA3和Rab16A）的激活。值得注意的是，SAG9抑制若干LEA相关输出但基本保持PER1A激活完整。结果表明SAG9调控的LEA转录和OsbZIP23–PER1A通路共享bZIP组分但保留不同的下游分支。核定位缺陷的有利单倍型改善耐贮藏性同时保持中等休眠，使SAG9成为可部署自然等位基因的强例子。因此，SAG9位点说明自然调控等位基因如何减弱bZIP介导抑制的一个分支而不废除整个保护网络。
**SA相关信号、蛋白质修复和保护代谢**
除上述ABA和生长素相关通路外，水杨酸（SA）为种子寿命增加另一个激素–氧化还原组分。对 contrasting 水稻材料的???组学和遗传分析将SA含量、ROS积累和种子存活与包含OsNPR1、PP2C30、bZIP03和bZIP28的网络联系起来。由于NPR1是氧化还原敏感的且PP2Cs与ABA信号互作，该网络可能在贮藏期间整合SA、ABA和氧化还原调控。进一步鉴定直接靶标和组织特异性互作将有助于完善这一调控分支的组织结构。
贮藏试验本身影响解释。升高的氧分压老化提供可重复的方式增强氧化损伤，而控制劣变结合高水分和温度并可能产生更强的膜和代谢损伤。整合转录组、代谢组和生理学研究表明人工老化期间抗氧化系统、油菜素内酯相关信号、呼吸和修复的反复变化。多组学分析为鉴定候选寿命网络提供宝贵资源，其机制解释可通过结合遗传扰动、启动子结合分析和下游功能验证来加强。然而，加速老化的实验便利性不应被解释为等同于长期自然贮藏。升高的氧气、高温或高水分可以加速特定类别的氧化、膜和代谢损伤，而环境贮藏下的劣化在更长时期内和波动环境条件下发展。因此，通过加速老化试验鉴定的调控因子应被视为耐贮藏性的候选决定因子，直到其效应在更长期自然或商业相关贮藏条件下被重现。当同一等位基因或调控通路在一种以上老化方案中显示一致效应且加速筛选能预测自然贮藏后表现时，机制结论最为有力。这一区分对育种尤为重要，因为种子库和商业种子系统需要在现实贮藏期内保持活力，而非对单一施加老化处理的抗性。
蛋白质修复提供发育保护与贮藏寿命之间的额外联系。OsHSFC1b激活HSPs和棉子糖家族寡糖基因，而异天冬氨酰修饰降低其功能；蛋白质L-异天冬氨酰甲基转移酶可以对抗这一损伤。因此，OsHSFC1b在老化响应中占据双重位置：它激活保护通路，但其自身活性随异天冬氨酰损伤积累而下降。当转录测量未平行分析转录因子完整性时，类似的蛋白质状态效应可能被忽视。因此，在评价种子老化期间的调控保护时，转录因子的功能状态可能与其表达水平同等重要。
**整合的氧化还原变阻器模型与证据边界**
种子寿命和成功萌发依赖干贮藏与种子吸胀之间氧化还原调控的协调转变。在贮藏期间，抗氧化和修复系统限制氧化损伤的渐进积累，而在吸胀之后，短暂且空间受限的ROS增加有助于胚乳弱化、休眠释放和萌发信号。如果吸胀后抗氧化活性保持过高，贮藏期间建立的保护状态可能延迟从代谢静止到活跃生长的转变。因此，最佳氧化还原程序将在干贮藏和早期吸胀期间结合强解毒与在特定时间和特定种子组织中受控形成ROS信号。这一氧化还原变阻器假说可以使用遗传编码氧化还原报告基因、胚胎和糊粉层组织的分开分析以及转录因子丰度、修饰和活性的时间分辨测量来检验。氧化还原变阻器模型将贮藏保护和萌发信号整合到单一时间框架中。
总体而言，OsARF12–OsbZIP23、OsbZIP23–PER1A和SAG9–class-E bZIP通路目前提供种子贮藏期间转录调控的最详细理解。新兴的SA–NPR1相关网络可能通过连接激素信号、氧化还原调控和种子寿命进一步拓展这一框架。因此，对这些调控机制的全面理解需要在不同老化方案下以及关键地在自然贮藏条件下验证。在加速和长期贮藏中重现相同寿命表型的调控因子可被视为更稳健的耐贮藏性决定因子，而仅在单一人工老化方案下检测到的效应应被解释为处理依赖性的，直到进一步验证。总之，这些通路形成分层贮藏保护网络，其中激素响应型bZIP模块协调抗氧化防御、LEA相关保护和蛋白质质量控制以在老化期间维持种子功能。
**休眠是可逆的保护程序**
**ABA和温度响应型休眠网络**
贮藏期间保持种子功能和控制萌发时间是种子表现的两个不同但连续的组分。贮藏保护通路决定种子是否保持重启代谢的细胞能力，而休眠决定该保持的能力何时被允许表达。因此，贮藏后成熟种子必须经历从受保护、生长受限状态到代谢再激活和胚胎生长的调控转变。种子休眠保护成熟籽粒免受穗发芽，而播种后及时释放对快速整齐成苗至关重要。这一权衡在温暖潮湿生产条件（增加穗发芽风险）和直播系统（同时需要快速同步萌发）下尤为重要。因此，休眠可被视为连接成熟和贮藏期间建立的保护与吸胀后激活的贮藏物质动员和生长程序的可逆时间门。图4说明休眠维持与贮藏物质动员之间的这一转变。在分子水平上，该门由整合ABA信号、温度、糖和能量状态、染色质调控和蛋白质稳定性的互连转录和翻译后网络控制。休眠作为定时保护程序发挥作用，其农艺价值取决于收获前建立和播种后释放。
OsVP1是成熟和休眠状态的核心正调控因子。它通过ABA信号激活Seed dormancy 4（Sdr4），一个主要驯化相关休眠基因。Sdr4本身作为种子休眠和驯化的调控因子被克隆，自然等位基因贡献栽培类群之间的变异。OsVP1-Sdr4关系说明主效B3因子如何将ABA响应转录与具有农艺后果的特定遗传位点联系起来。该轴将成熟相关ABA程序带入成熟后萌发控制。
OsWRKY29通过结合OsABF1和OsVP1启动子中的W-boxes以相反方向作用，从而削弱ABA响应性并促进休眠释放。由于OsWRKY29影响两个调控因子而非单一代谢基因，其操作可能具有广泛后果并需要阶段特异性部署。OsWRKY29通过协调降低两个促休眠调控因子充当ABA网络内的释放开关。
水稻种子休眠的温度依赖性变异部分由拮抗bHLH因子SD6和ICE2介导。SD6和ICE2直接调控ABA分解代谢基因ABA8OX3并通过OsbHLH048间接影响ABA生物合成基因NCED2。它们对ABA分解代谢和生物合成的相反效应改变ABA稳态，从而改变不同温度条件下的休眠深度。因此，SD6–ICE2–OsbHLH048模块为温度响应型休眠的自然变异和相关的穗发芽敏感性差异提供分子基础。温度感知嵌入ABA稳态网络内，将环境变异置于休眠深度的核心控制之内。
**休眠的翻译后和MFT中心控制**
休眠输出也通过转录因子的活性和周转控制。SDR3.1位点编码MODD，一个促进OsbZIP46蛋白失活和降解的调控因子。MODD与ABI蛋白互作，抑制其转录活性并促进低休眠状态；SDR3.1的自然变异和选择贡献籼稻和粳稻之间的差异。尽管MODD是共调控因子，它通过控制bZIP休眠因子的活性和稳定性直接塑造转录输出。MODD将休眠调控从启动子占据扩展到转录因子稳定性和活性的控制。
MFT中心复合物连接温度、ABA响应性和萌发速率。GF14h（编码14–3-3蛋白）中的自然插入缺失通过OREB1–OsMFT2模块改变温度依赖性萌发。OsMFT1和OsMFT2在水稻种子休眠中具有互补和部分冗余的作用。这些蛋白不是转录因子，但它们改变bZIP中心转录复合物的输出，展示支架和磷脂酰乙醇胺结合蛋白如何调节休眠门。MFT中心调控将非DNA结合蛋白定位为温度敏感休眠释放的主动决定因子。
**穗发芽的糖、能量和激素控制**
温度依赖性休眠也与灌浆期间的碳水化合物和能量状态耦合。OsbZIP58提供同一转录因子阶段依赖性复用的清晰例子。在籽粒发育期间，OsbZIP58调控淀粉和贮藏蛋白沉积；然而在成熟到萌发边界，其蛋白质稳定性成为PHS调控系统的一部分。高温通过糖感应激酶OSK3激活这一转变，OSK3在Ser46磷酸化OsbZIP58并促进其蛋白酶体降解。OsbZIP58缺失降低RAB16A激活，去抑制OsAmy3D，加速淀粉水解，增加可溶性糖并促进PHS。因此，OsbZIP58从籽粒发育期间的贮藏物质形成转变为PHS转变期间贮藏物质动员时间的调控，展示同一转录因子的输出如何跨阶段重新配置。
OsbZIP09定义休眠网络的独立ABA响应分支。OsbZIP09突变改变萌发和PHS，而结合RNA-seq和DAP-seq分析在其下游调控子中鉴定OsLOX2、LEA基因和其他候选。单个靶标的功能分析将阐明该调控子如何贡献表型。OsbZIP09调控子将脂质代谢和LEA相关保护置于控制休眠和穗发芽的ABA响应分支内。
休眠深度不仅由ABA响应转录的强度控制，还由决定激素可用性和转录状态本身能力的机制控制。这些调控层可以在机制上区分但汇聚于相同生理结果。OsAP2-39主要在激素代谢水平作用，通过激活OsNCED1和诱导EUI，从而增加ABA生物合成同时促进GA失活并将ABA/GA平衡转向休眠维持。OsEMF2b在染色质水平作用，在种子发育期间控制OsVP1的转录状态；OsEMF2b表达降低削弱休眠并可能导致胎萌。OsERF34将这一框架扩展到激素丰度之外，因为OsERF34缺失降低休眠并增加穗发芽，同时改变与激素代谢、氧化还原稳态和碳水化合物代谢相关的基因。因此，激素代谢、染色质调控、氧化还原状态和贮藏物质代谢不应被视为独立的休眠通路。相反，它们形成相互作用的调控层，决定成熟种子保持受保护、ABA主导状态的强度以及随后向萌发转变的难易程度。
**平衡穗发芽抗性与播种后萌发**
因此，水稻育种应优化种子休眠深度和休眠释放时间，使成熟籽粒能抵抗穗发芽同时允许播种后快速整齐萌发。而非组成性增加或降低休眠，通过发育阶段或环境响应型等位基因以及影响启动子活性、蛋白质稳定性或互作特异性的变异可能实现更大精准度，这些变异共同微调收获前后的转录因子活性。休眠调控的时间和幅度构成协调收获前保护与播种后萌发的核心育种参数。
水稻种子休眠由ABA代谢和敏感性、转录因子稳定性、糖和能量状态、温度信号和染色质调控的相互作用层控制。这些调控层汇聚于种子成熟期间建立、萌发期间释放的可逆保护状态。这一转变的精准度决定穗发芽抗性与快速成苗之间的平衡。
**萌发作为受控的代谢重启**
**吸胀、激素重置和贮藏物质动员**
一旦休眠释放，吸胀启动受控的代谢重启，将干燥、受保护的种子转化为生长的生物体。水分吸收恢复膜组织，启动线粒体修复，激活贮存mRNA的翻译并触发新转录。成功萌发需要ABA相关保护的下降与能量产生和氧化还原调控的协调。在水稻中，盾片和糊粉层协调水解酶产生与胚胎需求。种子发育和吸胀期间动态ABA和GA代谢为这一转变提供激素背景。这一过程将种子发育期间建立和贮藏期间保持的生理能力转化为可测量的萌发速度和整齐度。
贮藏物质动员是这一激素转变最早的代谢输出之一。油菜素内酯信号通过BZR1–RAmy3D模块促进贮藏物质动员。OsBZR1结合RAmy3D启动子，增加α-淀粉酶表达和活性，从而在早期萌发期间加速胚乳淀粉分解。同一水解程序在籽粒成熟期间的提前激活与穗发芽或籽粒品质改变相关。BZR1–RAmy3D模块将淀粉分解置于激素和时间控制下，使贮藏物质可及性与胚胎生长起始对齐。
**萌发期间的糖和能量感应**
一旦水解能力被激活，糖和能量感应决定贮藏物质动员进行的强度。糖饥饿通过SnRK1A-MYBS1级联感应。SnRK1A活性使萌发和幼苗生长期间MYBS1依赖的α-淀粉酶基因转录成为可能。在低氧下，该级联与CIPK15耦合，将钙和氧信号与糖可用性和能量产生联系起来。OsbHLH001–OsTPS8/Tre6P模块提供额外的跨阶段代谢连接。在籽粒发育期间，OsTPS8的调控变异影响籽粒代谢性状和种子活力潜力，而在吸胀之后，Tre6P依赖信号将蔗糖状态与α-淀粉酶输出耦合。这些通路汇聚于α-淀粉酶基因启动子，在那里油菜素内酯、糖、能量和氧信号被整合。α-淀粉酶的转录控制使贮藏物质动员速率与萌发种子的能量状态对齐。
**激素串扰和ROS稳态**
贮藏物质动员必须伴随允许胚胎生长的激素重置。ABA和生长素信号之间的协调贡献水稻种子萌发的调控。OsNAC3转录因子直接激活ABA分解代谢基因OsABA8ox1和细胞扩张基因OsEXP4，从而在萌发期间促进ABA降低和胚胎生长。在ABA依赖的生长素调控通路内，OsDREB1C激活OsNAC3和OsGH3.2的转录，而OsNAC3进一步直接激活OsGH3.2，导致早期萌发期间游离IAA降低。OsNAC3启动子的自然变异改变OsDREB1C结合并因此影响该调控模块的转录活性。因此，OsNAC3协调ABA分解代谢、细胞扩张和生长素稳态，将从休眠到萌发的转变与胚胎生长联系起来。
ROS稳态在水稻种子萌发期间也受OsNAC3依赖通路调控。OsNAC3直接激活OsITPK4的转录，产生的OsITPK4蛋白稳定ROS清除蛋白OsMT2b；因此，OsNAC3–OsITPK4–OsMT2b模块限制过度ROS积累并促进萌发。连同其在ABA分解代谢、细胞扩张和生长素稳态中的作用，这一ROS调控分支使OsNAC3能够在早期萌发期间协调激素再平衡、氧化还原稳态和胚胎生长。OsNAC3通过不同下游基因连接激素重置和ROS缓冲，允许胚胎生长在可存活氧化还原范围内进行。
**AP2/ERF、bHLH和整合萌发网络**
AP2/ERF因子将萌发调控从代谢再激活扩展到逆境下的早期成苗。遗传分析将OsRAV1直接与标准和盐条件下水稻种子萌发和早期幼苗表现联系起来。OsRAV1功能丧失突变延迟萌发，降低萌发和幼苗活力指数，并损害盐胁迫下的早期生长，表明OsRAV1贡献于快速萌发和成苗期间的盐胁迫耐受性。野生型和osrav1突变体之间的转录组差异涉及激素信号和苯丙烷代谢相关基因，表明观察到的活力表型源于生长调控和逆境响应代谢的协调变化而非单一下游过程。重要的是，OsRAV1不仅在培养皿萌发试验中评价，还在控制正常和盐条件下直接播种土壤后评价，其中改变的OsRAV1活性影响幼苗成苗和早期生长。这提供比仅平板萌发更强的成苗证据。然而，由于土壤实验在控制环境条件下而非重复田间试验中进行，OsRAV1目前应被视为有前景的直播稻候选因子，其田间稳定性仍有待验证。
OsbHLH035通过ABA依赖机制促进萌发，而盐暴露后的恢复部分依赖ABA非依赖分支。因此，萌发和逆境后恢复应作为表型的独立组分评价。两个调控分支区分处理期间萌发的能力和逆境解除后恢复生长的能力。
转录因子网络与连接贮藏物质利用和激素平衡的代谢调控因子共同运作。除转录因子外，水稻种子萌发还受连接代谢活性与激素平衡的非转录因子调控因子影响。OsBT1突变通过碳水化合物代谢变化改变种子休眠，而OsTPP1通过海藻糖代谢和ABA相关信号调节萌发，OsPK5将糖酵解活性与GA/ABA平衡联系起来。这些位点定义不同的代谢输出——包括碳水化合物利用、海藻糖代谢和糖酵解–激素耦合——转录调控通过这些输出影响休眠释放和胚胎生长。其他种子活力基因，包括OsHIPL1、OsIAGLU和一个编码2-酮戊二酸/苹果酸转运蛋白的基因，进一步表明成功萌发依赖膜相关过程、激素稳态和代谢物运输的协调调控。这些调控因子将萌发控制从转录信号扩展到为胚胎生长供应能量、激素和细胞底物的代谢和运输过程。
在这些通路中，萌发依赖贮藏物质释放、激素重置、氧化还原控制和细胞扩张的协调。吸胀后最初24–48小时涵盖从膜和线粒体修复到贮藏物质动员、胚胎扩张和早期幼苗生长在盾片、糊粉层和胚胎中的转变。这些事件的时间决定受保护干种子转化为活跃生长幼苗的速度和整齐度。
**环境胁迫揭示种子活力的条件性**
**萌发期间干旱和渗透胁迫**
在有利实验室条件下保持微妙的种子活力差异在萌发和早期成苗受到环境逆境挑战时常常变得明显。在直播稻中，水分亏缺、盐害、低温和缺氧干扰吸胀、贮藏物质动员、膜修复和胚胎生长，而其强度和组合在田块和生长季节之间变化。图5总结以下讨论的逆境响应调控模块，并说明尽管有逆境特异性信号通路，成功幼苗成苗依赖若干共享生理输出：ABA信号的及时调整、受控ROS积累、持续碳供应、膜功能恢复和持续细胞扩张。条件性种子活力反映当外部环境破坏代谢再激活和早期生长时这些核心过程的稳定性。
OsbZIP35对萌发的贡献是条件依赖的，在有利条件下仅有轻微表型效应但在渗透胁迫下效应显著。在聚乙二醇诱导的水分亏缺下，OsbZIP35敲除株系萌发和早期幼苗生长降低，而过表达株系表现改善，伴随ROS积累和抗氧化活性的相应变化。OsSAPK3磷酸化OsbZIP35并增强其调控活性，将该模块与逆境萌发期间氧化还原稳态的ABA响应控制联系起来。其他ABA响应型bZIP蛋白，如OsABF1，贡献营养组织中的耐旱性，但其是否直接调控水分亏缺下的种子萌发或早期成苗尚未被证明。OsSAPK3–OsbZIP35模块通过维持早期萌发期间氧化还原平衡定义渗透胁迫活力。
**盐害和低温胁迫**
盐害通过初始渗透约束水分吸收随后生长期间离子积累和毒性限制水稻幼苗成苗。OsRAV1贡献盐条件下萌发和早期幼苗生长的维持，而OsbHLH035调控响应的两个连续阶段：盐暴露期间ABA依赖的萌发促进和逆境解除后ABA非依赖的生长恢复。这些时间上不同的功能表明盐胁迫活力应通过测量处理期间萌发表现和幼苗转移到非盐条件后恢复生长的能力来评价。因此，盐害下快速萌发本身不能确保成功成苗，除非胚芽鞘和根生长、存活和逆境后恢复也得以维持。全基因组关联分析已鉴定与盐胁迫下萌发相关的自然等位变异，为确定候选转录因子及其下游通路如何影响盐耐受性特定组分提供遗传材料。盐胁迫活力包括在渗透限制下启动萌发和随着离子胁迫发展维持或恢复生长的能力。
低温通过减缓吸胀期间启动的细胞修复和代谢激活降低萌发速度。低温通过延迟吸胀后膜修复、代谢酶激活和胚胎生长限制水稻种子萌发。OsWRKY71缺失在正常和低温条件下均加速萌发并改变ABA受体基因和OsVP1–Sdr4–DOG1L休眠通路组分的表达。这些结果表明OsWRKY71通过在早期吸胀期间维持ABA响应和休眠相关转录负调控萌发。低温萌发性位点qLTG3-1和其他非转录因子位点进一步表明萌发期间低温耐受性也依赖转录因子网络之外的机制。QTL分析中检测到的强基因型×温度效应因此强调低温种子活力应在明确温度条件下评价而非从单一环境下的萌发推断。低温活力反映基因型在低温下恢复膜功能、放松休眠相关转录和恢复胚胎生长的速率（表4）。
**缺氧、厌氧成苗和复合胁迫**
缺氧将萌发的主要约束从水分吸收转向能量产生和碳分配。缺氧是湿润直播条件下水稻萌发和幼苗成苗的主要约束。尽管水稻胚芽鞘在淹水下比大多数其他谷物更有效地伸长，持续生长需要快速淀粉降解、糖酵解和发酵ATP产生以及碳向胚芽鞘伸长的受控分配。CIPK15–SnRK1A–MYBS1通路在缺氧下促进α-淀粉酶表达，从而在厌氧萌发期间维持淀粉动员和碳供应。TPP7通过调节海藻糖-6-磷酸代谢和维持支持幼苗生长的源–库关系进一步增强厌氧萌发耐受性。ERF-VII转录因子调控水稻中更广泛的低氧响应，特别是在幼苗生长期间，而其直接靶标和种子萌发最早阶段的功能仍不太清楚。厌氧种子活力依赖将有限淀粉储备转化为足够ATP并引导可用碳向快速胚芽鞘伸长。
在田间条件下，环境胁迫常依次或组合发生，在一个阶段有益的生理响应可能在另一阶段约束种子表现；增强的ABA信号可以改善水分亏缺耐受性但也延迟休眠释放和萌发；快速贮藏物质动员可以在缺氧下维持胚芽鞘伸长但可能在根伸出前耗尽碳储备；强抗氧化保护可以减少老化相关损伤同时抑制萌发所需的短暂ROS信号。因此，逆境响应型转录因子的效应应结合所检查的逆境条件和发育阶段评价，因为同一下游程序可能增强逆境期间存活但损害萌发、恢复或后续幼苗成苗。逆境适应是阶段依赖的，其价值由从逆境下萌发到恢复和土壤成苗的完整序列定义。
同一遗传材料的跨逆境比较区分广泛作用的活力调控因子和逆境特异性调控因子。在渗透胁迫、离子胁迫、低温和缺氧下评价同一遗传材料将有助于确定调控因子影响多种逆境共享的生理过程还是主要在特定逆境条件下发挥作用。由于逆境可能不同地影响成苗的连续阶段，胚根突出、胚芽鞘伸长、根伸出、逆境后生长恢复和土壤成苗应分别量化而非合并为单一活力指数。这些性状的分别测量揭示基因型是改善逆境存活、萌发启动、持续生长还是成苗稳定性。
**共享和逆境特异性转录模块**
逆境响应型转录因子调控萌发和早期幼苗成苗的不同组分而非产生种子活力的统一改善。OsRAV1贡献盐害下萌发和早期幼苗生长，OsbHLH035调控盐暴露期间萌发和逆境解除后生长恢复，而OsbZIP35的效应在渗透胁迫下通过其ROS稳态和抗氧化活性调控最为明显。这些差异表明逆境响应型调控因子的育种价值应针对目标直播环境的 principal 约束以及从萌发到逆境后恢复和土壤成苗的连续阶段来评估。逆境响应型转录因子塑造成苗过程的特定片段，其农艺效应源于调控功能、逆境类型和发育阶段之间的匹配。
**超越单一转录因子的调控逻辑**
**启动子语法和组合转录因子复合物**
转录因子输出由DNA结合特异性之外的因素塑造。伙伴组成、磷酸化、蛋白质周转、染色质状态和组织背景可以将同一因子在种子生命周期不同阶段重定向至不同靶标。这些层解释为什么相关转录因子可以具有不同功能以及为什么同一转录因子可以保护发育中种子但约束萌发中种子。种子活力调控由转录因子作用的分子背景而非仅因子身份产生。
启动子结构提供转录因子产生靶标特异性输出的一种机制。组合启动子调控由OsbZIP58（RISBZ1）和RPBF说明，它们识别相邻的GCN4样和醇溶蛋白框基序并冗余或协同作用调控贮藏蛋白基因。类似地，NF-YB1、NF-YC12和bHLH144形成直接激活Wx表达的转录复合物。这些例子表明顺式元件的身份和排列影响转录因子复合物在特定启动子上的招募和活性。因此，这些顺式元件的靶向修饰可能有助于阐明单个调控关系并调整选定下游基因的表达。在水稻胚乳中，多个转录因子与靶基因启动子中的特定顺式调控元件相互作用以协调贮藏物质合成和胚乳发育。
**蛋白质状态调控和伙伴依赖特异性**
蛋白质状态在启动子选择之后提供调控特异性的第二个来源。翻译后调控是水稻种子中转录因子活性的另一个重要决定因素。TRAB1和bZIP23通过SAPK/SnRK2激酶磷酸化激活，而OSK3依赖磷酸化促进OsbZIP58的不稳定化，MODD抑制bZIP蛋白的活性和稳定性。这些例子表明转录本和蛋白质丰度单独可能不能准确反映转录因子功能，因为活性还可以通过磷酸化、蛋白质互作、亚细胞定位和降解改变。因此，将转录组分析与磷酸化、蛋白质互作和降解测量整合将提供种子发育、贮藏和萌发期间转录因子调控的更准确评估。转录因子的功能输出反映其所检查阶段的修饰、定位、互作状态和稳定性。
伙伴蛋白可以决定阶段特异性。SAG9抑制选定的class-E bZIP输出，GF14h调节OREB1-MFT2复合物，OsARF12控制OsbZIP23转录。这些发现表明支架、激酶、蛋白质周转调控因子和互作界面可能为修饰选定转录因子输出提供额外育种靶标。伙伴依赖调控将广泛转录因子活性划分为阶段和靶标特异性输出。
**染色质、表观遗传和非编码RNA调控**
基于染色质的调控也通过控制关键基因的转录可及性贡献种子休眠和萌发。Polycomb组蛋白OsEMF2b调控OsVP1表达和种子休眠，而组蛋白去甲基化酶OsJMJ718影响萌发相关基因表达。由于胚胎、糊粉层和胚乳执行不同功能，其染色质状态可能不同并在吸胀期间变化。细胞类型分辨的转录组和染色质可及性分析有助于确定这些调控变化发生的地点和时间。染色质调控建立转录因子网络控制休眠释放和萌发的组织特异性边界。
非编码RNA也可能参与贮藏和老化期间种子活力的调控。老化相关miRNA，包括miR168a，已在超干贮藏和人工老化下与抗氧化和激素相关响应联系起来。然而，这些miRNA在种子中调控的直接靶标和转录因子通路仍未充分界定。miR2105–OsSAPK10–OsbZIP86模块表明miRNA调控可以将激酶信号与水稻ABA生物合成联系起来，尽管其对种子活力的贡献仍需种子特异性验证。miRNA介导的调控增加转录后层，能够在种子生理状态变化期间调整激素和逆境响应通路。
**多组学整合和时空分辨**
组学分析可以鉴定与种子活力相关的候选调控因子和调控关系。与已知活力相关因子显示广泛共表达或互作的基因或蛋白为进一步验证提供有用优先级。然后应通过遗传扰动、生化试验和启动子结合分析检查其作用以确定它们是否直接调控特定种子活力过程。因此，仅网络连接性不足以确立调控重要性，除非有明确分子功能的证据。强机制证据要求转录因子扰动与启动子占据、下游基因表达或生理过程变化以及通过互补或拯救恢复相应种子表型联系起来。组学网络的解释价值在于连接调控因子、其分子靶标和种子活力特定组分的因果关系（表5）。
时空分辨还要求跟踪同一遗传效应跨越种子生命周期的连续阶段。在灌浆、贮藏和萌发中评价同一等位基因和种子批可以确定其效应是否跨阶段保持或产生后期权衡。这种阶段连续分析对OsbZIP58、OsNAC3和OsHSFC1b等影响多个发育和生理过程的调控因子尤为重要。跨阶段评价将调控因子的分子功能与种子活力建立、保持和表达的完整轨迹联系起来。
种子活力调控源于启动子结构、转录因子复合物、蛋白质状态、染色质可及性、非编码RNA和发育背景的综合效应。这些调控层将有限的一组转录因子转化为种子生命周期中阶段、组织和逆境特异性输出。
重要的是，这些阶段特异性输出不是孤立的调控事件。若干反复出现的机制连接种子生命周期的连续阶段：ABA响应型B3/bZIP信号连接成熟与休眠；氧化还原调控从贮藏期间防止氧化损伤转向萌发期间受控ROS信号；糖和能量通路连接贮藏物质沉积与贮藏物质动员；蛋白质状态调控通过磷酸化、降解、伙伴交换或积累的蛋白质损伤重定向转录因子活性。这些关系表明种子活力源于共享调控系统的阶段依赖性复用和重新配置。
**改良水稻种子活力的遗传和基因组策略**
**从调控机制到育种靶标**
组成性过表达有助于确定转录因子功能，但持续激活可能对开花、株型、休眠、产量和籽粒品质产生多效性影响。因此，对于育种应用，微调转录因子活性的调控特征——如启动子变异、靶标顺式元件、磷酸化位点、降解子或蛋白质互作界面——可能比修饰整个基因提供更大精准度（图6）。种子活力改良依赖在保持广泛作用转录因子发育功能的同时调节调控输出。
自然变异提供已经通过水稻发育和适应过滤的调控等位基因。有利等位基因可以改变调控强度或时间同时保持正常植株发育。3,000水稻基因组资源和扩展的长读长泛基因组提供对启动子变异、结构变异、转座子插入和稀有编码等位基因的获取。有利例子已包括控制温度依赖性萌发的GF14h等位基因、影响休眠的SDR3.1变异、影响耐贮藏性的SAG9单倍型、影响高温PHS的OsbZIP58单倍型、影响萌发和盐耐受性的OsRAV1单倍型以及控制垩白和活力的OsTPS8启动子变异。OsSV5增加一个具有有利单倍型的近期QTL衍生转录因子候选。早期QTL定位研究鉴定萌发阶段活力和幼苗成苗的多个位点，为网络引导的精细定位提供基础。这些等位基因将大部分有用变异置于调控时间、表达强度、蛋白质定位和环境响应性中。
**多环境表型鉴定和多组学网络构建**
高分辨基因组变异的价值取决于种子生命周期中同等分辨的表型鉴定。多样性 panel 应评价完整穗上的穗发芽、控制和自然老化、萌发动力学以及在干旱、盐害、低温和缺氧下的出苗。种子生产环境和贮藏历史应作为协变量包括。种子成熟度、生产环境、贮藏历史和试验条件的标准化记录对于在关联分析中区分内在遗传效应与母体和环境变异很重要。种子活力等位基因只有在其表型与明确的生产历史、贮藏方案、发育阶段和逆境条件联系起来时才可解释。
多组学网络构建为多环境表型鉴定增加分子分辨率。当转录组、染色质、蛋白质、代谢物和表型数据从同一组织和发育窗口获得时整合最具信息量。这些数据类型之间的汇聚有助于优先考虑调控关系进行功能验证。多组学的价值在于在同一生物背景内连接调控变异与其分子输出和种子表型。
**编辑启动子、顺式元件和蛋白质状态**
基因组编辑使每个调控层能够在适当的分子尺度上修饰。启动子编辑调整表达时间或幅度；顺式元件编辑修饰特定转录因子–靶标关系，如PER1A ABRE或OsTPS8启动子中的OsbHLH001结合位点；碱基或引导编辑可以改变磷酸化位点、降解子、定位信号或互作界面。多重编辑可以组合保护、休眠和萌发模块中的适度等位基因。水稻碱基和引导编辑平台已足够成熟以测试这些策略。
**组织和阶段特异性工程**
空间和时间限制提供将有利种子效应与全株多效性分开的额外手段。胚乳启动子适合贮藏物质和蛋白质稳态模块；胚胎或盾片启动子可以靶向萌发；糊粉层启动子可以控制运输或水解酶；诱导型启动子可以响应贮藏或播种条件。合成启动子设计应保持定量控制，因为过强表达可能产生代谢成本。组织和阶段特异性表达将调控活性限制在所需种子活力性状产生的时间和位置。
**等位基因聚合、基因组预测和多性状验证**
有效等位基因聚合结合在种子生命周期互补阶段发挥作用的调控功能。一个互补组合可以包括用于种子耐贮藏性的中等效应SAG9或bZIP通路等位基因、用于穗发芽抗性的阶段响应型休眠等位基因、用于播种后快速萌发的OsTPS8或OsRAV1等位基因以及改善目标环境逆境下成苗的等位基因。由于若干这些调控因子汇聚于ABA–bZIP信号，应评估其上位性互作而非假设其效应可加。等位基因聚合的价值在于贮藏、休眠释放、萌发和成苗之间的功能互补。
基因组预测将等位基因聚合扩展到集体塑造种子活力的许多小效应位点。预测模型可以将这些位点与种子生产环境和贮藏条件整合。多性状指数提供比仅最终萌发率更具代表性的选择目标。该指数可以对穗发芽、老化敏感性、萌发延迟、逆境诱导死亡以及产量或籽粒品质降低赋予负权重。这样的指数将种子活力的时间定义转化为平衡收获前保护、贮藏存活、萌发、成苗、产量和籽粒品质的选择标准。
OsTPS8、SAG9、SDR3.1、GF14h和OsbZIP58的自然等位基因揭示反复出现的模式：有利变异调整调控时间、表达强度、蛋白质定位或信号敏感性同时保持核心基因功能。水稻种子活力改良最有效地通过精准调节调控通路在种子生命周期中作用的时间、地点和强度来实现。水稻种子活力的遗传改良正从转录因子基因的广泛改变转向自然调控变异、启动子和蛋白质状态编辑、组织特异性表达、互补等位基因组合和多性状基因组预测的精准利用。这些策略将种子活力的时间性质转化为协调发育、贮藏、休眠、萌发和逆境成苗的育种设计。
**当前挑战和未来展望**
尽管在鉴定水稻种子活力转录调控因子方面进展迅速，若干反复出现的局限仍限制机制解释和育种转化。这些包括活力定义和表型鉴定不一致、过度依赖人工老化、组织和蛋白质状态分辨不足、调控等位基因的阶段特异性而非纵向评价、直播田间条件下验证有限以及频繁使用基于关联的组学而缺乏完整因果验证。这些局限相互关联：通过转录组学鉴定的候选调控因子不能被视作稳健育种靶标，除非其分子功能与明确生理过程联系、在种子生命周期相关阶段重现并在现实贮藏或成苗条件下验证。因此，未来研究应从鉴定额外候选调控因子转向建立可重复的因果和转化证据。
**标准化表型和建立贮藏相关性**
种子活力在不同研究中仍有不同定义，最终萌发、萌发速度、幼苗生长、耐贮藏性和老化后存活被用作部分重叠的代理。这种异质性限制跨研究调控效应的直接比较。为提高可比性，研究应报告种子年龄、生产环境、后熟处理、水分含量、试验温度以及复合活力指数使用的确切公式。当声称涉及农艺活力时，萌发动力学和田间出苗应伴随最终萌发。因此，共享表型鉴定框架对于区分真实调控效应与种子历史或试验设计造成的差异至关重要。
当前寿命研究主要依赖加速老化和控制劣变试验。这些方法对快速筛选和实验解剖氧化、膜和代谢响应仍有价值，但应被视为筛选和机制工具而非长期贮藏验证的替代。不同老化方案施加不同组合和速率的损伤，因此高温、高水分或高氧处理后观察到的表型未必能预测长期环境贮藏期间的表现。因此，未来研究应采用分层验证策略。候选寿命调控因子可首先使用可重复的加速老化试验筛选，然后跨机制不同的老化方案如控制劣变、高氧或干老化比较，最后进行自然或商业贮藏。旨在用于育种的优先等位基因应使用多季节生产并贮藏农业相关持续时间的种子批测试，并记录贮藏温度、相对湿度、种子水分含量和包装条件。种子批重复尤为重要，因为母体和种子生产环境可以强烈影响后续活力。因此，自然贮藏验证应作为区分广泛有效寿命机制与特定人工老化处理特异性响应的转化基准。
对于实际部署，当加速筛选和长期自然或商业贮藏鉴定相同遗传效应时获得最强证据。这种一致性将使人工老化作为有效预测筛选工具发挥作用，同时确保选定等位基因在种子库、商业贮藏和生产条件下保持价值。
**解析细胞类型网络和转录因子蛋白质状态**
一个主要机制局限是频繁从全种子转录本丰度推断转录因子功能。胚胎、盾片、糊粉层和淀粉质胚乳执行不同生理功能，因此bulk测量可能掩盖细胞特异性甚至相反的调控响应。因此，组织和细胞分辨方法应有选择地用于确定候选调控互作实际发生的地点，而非简单生成更高维数据集。
转录本丰度也未必反映转录因子活性。磷酸化、泛素化、蛋白质损伤、细胞内定位、伙伴交换和降解可以独立于mRNA丰度改变调控输出。因此，关键目标不是简单添加转录组、蛋白质组和染色质数据集，而是将明确种子细胞类型中转录因子的活跃分子状态与其直接靶标和相应生理表型联系起来。候选调控残基的原位基因编辑和遗传拯救应为这些关系提供特别强的检验。
**纵向等位基因分析和种质多样性**
大多数有利等位基因在其最初发现的阶段被表征，而其在后期阶段的后果很少被系统跟踪。这产生选择改善一个活力组分同时将成本转移到贮藏、休眠、萌发或成苗的等位基因的风险。因此，当提出调控等位基因用于育种时，同一基因型和种子批应从种子生产到贮藏、萌发和成苗纵向跟踪。
一个实用策略是建立自然和精准编辑等位基因的共享 panel，在标准化环境下生产并使用相同表型鉴定流程跨阶段评价。纵向分析不应仅问等位基因是否改善单一性状，而应确定其益处是否在后期阶段持续、消失或产生权衡。种质和泛基因组资源对等位基因发现仍有价值，但其育种效用将取决于这种阶段连续的表型验证。
更广泛的种质多样性扩展可用于种子活力改良的调控变异。亚种和野生稻多样性仍未充分开发。籼稻、粳稻、aus、香稻和野生材料在休眠、环境适应和启动子结构上不同。长读长泛基因组应用于发现基于SNP的GWAS遗漏的结构和调控变异，而近等基因系应将因果等位基因与群体结构分开。种质多样性将等位基因发现从常见SNP扩展到谱系特异性调控和结构变异。
**多逆境田间验证和部署情境**
阶段连续等位基因分析只有在机制证据与环境验证区分时才具有农艺意义。当前大多数研究在实验室或单一逆境控制条件下评价种子表现，而直播田块将种子暴露于水分可用性、盐害、温度、氧气供应、播种深度、土壤机械阻力、微生物和杂草竞争的相互作用变异。因此，强分子证据本身不能确立农艺价值。若干代表性调控因子说明这一区分：OsbZIP23–PER1A通路在加速老化、遗传和分子分析中得到机制上的充分支持但缺乏土壤和重复田间出苗验证。OsRAV1已进展到正常和盐条件下控制土壤播种实验，但重复田间验证仍然缺失；OsTPS8相关活力已通过控制萌发和土壤幼苗试验确认，而其在实际直播稻田间条件下的表现仍未解决。
因此需要渐进验证层级以防止控制环境表现被过度解释为田间就绪。实验室萌发应提供初始表型证据，控制逆境和土壤成苗试验应测试环境稳健性，重复多环境田间试验应确定农艺稳定性。结合温度、水分 regime、盐害、氧气可用性和播种深度的多因子实验可以作为鉴定在相互作用逆境下仍有效等位基因的中间步骤。只有其效应在实际播种条件下可重复的调控因子才应被描述为田间验证的。最终，田间相关种子活力应由稳定出苗、恢复和早期成苗而非仅快速萌发来判断。
**加强多组学因果证据**
多组学对产生和优先考虑调控假设最有价值，但仅网络连接性、共表达或富集不能确立因果关系。令人信服的种子活力机制应将调控因子与直接分子靶标联系，证明由此产生的生理变化，并在同一生物背景中重现相应种子表型。原位基因座扰动、直接结合试验、下游互补或拯救以及跨相关环境表型重现为这种因果链提供逐渐增强的证据。
因此，未来主要挑战不是构建更大调控网络，而是将其缩减为实验可检验的因果关?系并确定哪些关系在现实贮藏和田间条件下仍然有用。满足因果和转化标准的调控等位基因应优先用于育种，而缺乏直接功能验证的关联应明确归类为候选。
总之，本文综述的证据支持一个整合跨阶段模型，其中水稻种子活力源于共享调控系统在种子生命周期中的协调复用和重新配置（图7）。发育程序建立胚胎发育能力、贮藏物质组织和保护能力；贮藏网络通过氧化还原控制、解毒和蛋白质维持保持这些能力；休眠和萌发网络将激素、ROS和碳信号重定向至贮藏物质动员和胚胎生长；逆境响应型转录程序决定这一潜力是否成功转化为幼苗成苗。若干调控因子直接桥接这些阶段。OsVP1连接成熟相关ABA响应转录与休眠控制；OsbZIP58连接贮藏物质沉积与温度依赖性PHS和贮藏物质动员；OsHSFC1b连接发育保护与贮藏相关蛋白质损伤；OsTPS8/Tre6P连接籽粒代谢状态与萌发阶段碳动员。图7将这些关系整合为从种子形成到幼苗成苗的单一调控连续体。
**结论**
本综述讨论的调控机制将水稻种子活力定义为在灌浆期间建立、贮藏期间保持并通过休眠释放、萌发和幼苗成苗表达的生命周期性状。在种子发育期间，转录网络建立胚胎发育能力、贮藏物质组织、营养供应、蛋白质稳态和耐脱水性，而后续网络保持这些能力、重置激素和能量状态、动员贮藏物质并在环境逆境下稳定早期生长。水稻种子活力代表从种子形成到幼苗成苗的生理和调控能力的连续性。
在这一生命周期框架内，调控活性的时间、位置和幅度成为育种价值的核心决定因素。调整转录因子作用地点、时间或强度的自然或编辑变异可以改善选定种子活力组分同时保持其在其他发育阶段的功能。可比表型鉴定、同一等位基因和种子批的纵向评价、细胞分辨多组学、调控关系的直接验证以及跨 contrasting 生产环境的测试提供将分子机制与稳定农艺表现联系所需的证据。精准调控控制为组合种子耐贮藏性、穗发芽抗性、快速萌发和稳定幼苗成苗提供连贯途径。
