《Archives of Microbiology》：RDAR biofilm formation and in silico analysis of putative amyloid proteins in Azospirillum baldaniorum Sp245
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Azospirillum baldaniorum Sp245是一种植物促生根际细菌（PGPR），其促进宿主作物生长的能力依赖于稳健的根系定殖，这一过程由浮游态向固着态、生物被膜相关生活方式的转变所驱动。本研究考察了A. baldaniorum Sp245形成红
Azospirillum baldaniorum Sp245是一种植物促生根际细菌（PGPR），其促进宿主作物生长的能力依赖于稳健的根系定殖，这一过程由浮游态向固着态、生物被膜相关生活方式的转变所驱动。本研究考察了A. baldaniorum Sp245形成红色、干燥、粗糙（RDAR）形态型生物被膜的能力。通过宏观评估和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），研究人员利用Calcofluor White（CFW）、Thioflavin S（TS）和碘化丙啶（PI）荧光探针，分别可视化了RDAR生物被膜基质中胞外多糖、推定淀粉样蛋白和胞外DNA（eDNA）的存在。此外，对胞外基质蛋白提取物进行甲酸处理提示存在抗性、推定的淀粉样蛋白。由于基因组筛查显示缺乏典型curli依赖性淀粉样系统的同源物，研究人员进行了全基因组计算机模拟分析，以鉴定编码替代性生物被膜相关蛋白的基因。以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）生物被膜相关蛋白（Bap蛋白）为参考，研究人员鉴定出20个候选蛋白，其特征为广泛的结构域重复和多样的架构，包括细菌免疫球蛋白（Ig样）结构域、VCBS重复序列、SWM基序、DUF4347、PKD结构域和RTX β-roll结构。三维建模表明，这些候选蛋白具有细长的、纤维状构象，带有典型的淀粉样样组装和钙依赖性黏附的重复β-链基序。这些发现提示，在缺乏传统curli机制的情况下，A. baldaniorum Sp245可能利用多样化、富含结构域的替代性基质蛋白库来促进细胞表面相互作用、协调结构稳定性并建立RDAR生物被膜形态型。最终，本研究为理解淀粉样蛋白在Azospirillum生物被膜基质形成中的作用奠定了基础，并为该菌在根际的持久性和生态适应性潜在机制提供了新见解。
一、研究背景与科学问题
Azospirillum baldaniorum Sp245是一种被广泛研究的植物促生根际细菌（PGPR），其促进农业生产的机制包括生物固氮以及合成吲哚-3-乙酸（IAA）、细胞分裂素和赤霉素等植物激素。然而，这些生理益处的发挥严格依赖于对宿主植物的稳健定殖，而这一过程与细菌从浮游态向固着态生物被膜生活方式的转变密切相关。在自然环境中，生物被膜生活方式通过将细菌群落包裹在自身产生的胞外基质中而提供战略优势，该基质作为结构支架和物理化学屏障，赋予机械抗性、营养螯合以及抵御干旱等非生物胁迫的保护能力。
既往对Azospirillum生物被膜的研究主要局限于液-固界面的浸没培养体系，而气-固界面（琼脂培养基）上形成的生物被膜胞外基质组成在该属中尚未被探索。在肠道细菌如大肠杆菌（Escherichia coli）和鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）中，琼脂平板上发育的生物被膜表现出一种独特的宏菌落形态型，称为RDAR（红色、干燥、粗糙），该表型由c-di-GMP第二信使严格调控，由纤维素和功能性淀粉样蛋白（如curli黏附素）的协调表达驱动。然而，与依赖csg操纵子进行curli组装的肠道细菌不同，PGPR Azospirillum缺乏curli编码基因。因此，对A. baldaniorum Sp245在琼脂平板上气-固界面群落及其胞外基质组成认识的缺乏，构成了理解该菌在波动环境条件下维持生态适应性和持久定殖机制的重要空白。本研究旨在填补这一空白，系统考察A. baldaniorum Sp245的RDAR型生物被膜发育及其基质组成，并通过计算机模拟分析鉴定替代性淀粉样蛋白候选基因。
二、主要技术方法
研究人员采用了多层次的实验与计算策略。首先，通过刚果红（CR）和考马斯亮蓝（CBB）琼脂平板染色进行宏菌落形态型评估；利用倒置琼脂法结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），以Calcofluor White（CFW）、Thioflavin S（TS）和碘化丙啶（PI）三种荧光探针分别可视化胞外多糖、推定淀粉样蛋白和胞外DNA（eDNA）的空间分布；通过荧光显微镜观察细胞表面推定淀粉样蛋白；采用1.5 M NaCl提取胞外基质（ECM）蛋白并进行甲酸处理结合SDS-PAGE分析。在生物信息学方面，以金黄色葡萄球菌V329的Bap蛋白（登录号AAK38834.2）为参考序列，对A. baldaniorum Sp245全基因组进行BLAST搜索，利用SMART平台预测功能结构域，并通过AlphaFold3进行蛋白质三维结构预测，使用ChimeraX软件进行结构分析与比对。
三、研究结果
RDAR形态型的建立与基质组成分析
研究人员发现，A. baldaniorum Sp245在无NaCl的改良LB培养基上培养5天后，可形成与肠杆菌科中报道的RDAR形态型相似的行为。在补充CR的培养基上，宏菌落呈现红色、干燥、粗糙的外观，并组织为三个不同的同心区域：中心区（I区）呈现随机取向的桥状皱纹密集网络；中间区（II区）呈现突出的径向取向桥状结构；外环区（III区）为狭窄的周边区域，缺乏复杂架构而呈现褶皱结构。当CR与CBB联用时，菌落变为棕色、干燥、粗糙，提示蛋白丰度增加。CFW和TS染色均未抑制RDAR表型，宏菌落保持干燥粗糙外观并表现出良好荧光，表明存在CFW结合型胞外多糖和TS结合型蛋白。
CLSM三维可视化与细胞表面分析
通过CLSM结合倒置琼脂法，研究人员在10倍和60倍物镜下观察到宏菌落中丰富的胞外多糖（CFW蓝色荧光）、推定功能性淀粉样蛋白（TS绿色荧光）以及eDNA或膜受损细胞（PI红色荧光）。三维重建和延时拍摄进一步定位了参与生物被膜胞外基质构建的各组分。补充荧光显微镜（100倍物镜）使用FM4-64（膜磷脂检测）和TS染色提示推定功能性淀粉样蛋白存在于细胞表面。
ECM蛋白提取与甲酸抗性分析
研究人员按照已报道的提取方案从宏菌落生物被膜中提取ECM蛋白，并利用淀粉样蛋白对甲酸处理的特征性抗性进行分析。SDS-PAGE结果显示，经甲酸处理的样品中存在抗性蛋白条带，而未经处理的样品中部分蛋白被降解，这提示生物被膜基质中存在淀粉样型蛋白。
计算机模拟预测与结构分析
由于基因组筛查未发现CsgA或csgBAC-csgDEFG操纵子的同源物，表明A. baldaniorum Sp245缺乏典型curli依赖性淀粉样系统，研究人员以S. aureus V329 Bap蛋白为参考序列进行全基因组筛选，共鉴定出20个推定蛋白，长度范围为542至4,732个氨基酸残基。这些蛋白的结构域架构高度多样，包含VCBS、Ig样、SWM、DUF4347、BIg-3-2、溶血素钙结合、PKD和FN3结构域以及多种氨基酸重复序列，且表现出广泛的结构域重复，每条序列含5至22个重复。AlphaFold3预测的三维模型显示这些候选蛋白具有细长的纤维状构象。细菌免疫球蛋白样（BIg）折叠由约74至120个氨基酸以串联β-三明治基序排列而成，常与RTX重复或β-roll支架整合。RTX β-roll架构分析显示反平行的β-折叠片通过典型钙结合基序相互连接，保守的钙结合基序（GGXGXDXXX）在七个预测蛋白中被鉴定。SWM结构域表面具有由极性残基（保守丝氨酸和酸性侧链）包围的浅沟，尽管与典型RTX重复存在序列差异，SWM模块仍采用RTX样β-roll折叠。此外，WP_10913937.1蛋白表现出五叶片VCBS β-螺旋桨结构，每个叶片由四链β-回折组成，径向排列形成围绕中央通道的环形折叠。对CCD02597.1、WP_247893209.1、WP_247893211.1和WP_244439538.1的结构分析提示其与菌毛黏附素和淀粉样相关蛋白功能相关。
四、讨论与结论
本研究表明A. baldaniorum Sp245在气-固界面（琼脂培养基）成功发育RDAR宏菌落形态型，这是RDAR范式在PGPR中的重要扩展。与经典肠道模型中RDAR表型与curli菌毛和纤维素共表达相关不同，A. baldaniorum宏菌落表现出染料依赖性色素沉着差异：单独CR呈红色，CR加CBB呈棕色，提示胞外蛋白与胞外多糖协同构成ECM。显微分析表明该生物被膜的结构完整性依赖于由胞外多糖、eDNA和推定淀粉样蛋白组成的复杂胞外基质。甲酸抗性蛋白的存在和TS荧光为淀粉样样蛋白的存在提供了有力证据。在缺乏典型curli机制的情况下，计算机模拟分析揭示了包括Bap样序列、Ig样结构域、VCBS结构域、SWM重复和RTX β-roll结构在内的保守淀粉样生成基序的复杂景观，这些特征在其他模式微生物中与生物被膜稳定性密切相关，提示这些结构在A. baldaniorum中具有功能保守作用。
结论：本研究证明PGPR A. baldaniorum Sp245能够在气-固界面成功发育RDAR宏菌落形态型。显微分析提示该生物被膜的结构完整性依赖于由胞外多糖、eDNA和推定淀粉样蛋白组成的复杂胞外基质。虽然直接实验验证目前受到候选基因广泛多样性和经典遗传敲除及抗体检测技术挑战的限制，研究人员提供了支持淀粉样样结构存在的有力初步证据。此外，计算分析揭示了保守淀粉样生成基序的复杂景观，包括Bap样序列、Ig样结构域、VCBS结构域、SWM重复和RTX β-roll结构，这些特征与其他模式微生物中的生物被膜稳定性密切相关。未来研究应优先对这些蛋白进行鉴定和功能表征，并扩展基因组分析以确认其在生物被膜组装中的作用。对这些淀粉样相关组分的深入理解可为植物-微生物互作提供见解，并促进可持续农业中更有效生物接种剂的开发。
