巴西潘塔纳尔高盐碱湖新分离菌株Vreelandella zhaodongensis BS253的功能基因组学分析：极端环境微生物的代谢多样性与生物技术潜力

《Archives of Microbiology》：Functional genomic analysis of Vreelandella zhaodongensis BS253: a new isolate from hypersaline lakes from Brazilian Pantanal

　　

专业术语翻译摘要： 自然生态系统蕴藏着代谢能力尚未被充分探索的庞大微生物多样性。因此，对多样环境中微生物生命的研究可揭示具有独特生理和生化特性的细菌，这些特性可能具有生物技术应用价值。本研究报道了分离自巴西潘塔纳尔（Pantanal）地区高盐碱湖的菌株BS253的完整基因组测序与功能表征。研究人员采用结合牛津纳米孔（Oxford Nanopore）长读段和Illumina短读段的混合测序策略，组装了一个3.76 Mb的环状染色体和两个质粒。系统发育和比较基因组学分析将该分离菌株鉴定为Vreelandella zhaodongensis。数字DNA-DNA杂交（dDDH，76.4%）和平均核苷酸一致性（ANI，96.83%）数值支持将BS253指定为V. zhaodongensis的一个菌株。基因组挖掘揭示了与耐盐耐碱、烃类和塑料降解以及次级代谢产物生物合成相关的潜在基因。在表型上，BS253是一种中度嗜盐、兼性厌氧、革兰氏阴性杆菌，在特定培养条件下还表现出乳化活性（55.1%）。这些发现凸显了菌株BS253作为一种代谢多样的极端微生物，是未来环境与工业生物技术研究的有前景候选菌株。

论文解读文章：

一、研究背景与科学问题

极端环境微生物因其独特的分子适应机制和代谢能力，已成为生态学理解与生物技术创新领域的重要研究对象。极端环境对微生物施加选择性压力，促使微生物演化出独特的分子适应机制以维持生存，其中包括产生特殊代谢产物（一类有助于生物体适应周围环境的天然产物）以及胞外两亲性生物聚合物如生物乳化剂（bioemulsifiers）。生物表面活性剂能够降低双相系统中的表面张力和界面张力，促进乳化与分散等过程，这类分子已在高盐湖、盐田、寒冷环境、深海热液喷口、石油储层和碱性栖息地的微生物中被广泛描述。由于生物乳化剂在盐度、温度和pH等工业条件相近的环境中仍能保持活性，因此被认为是工业生物过程和生物修复领域有前景的候选分子。

巴西潘塔纳尔（Pantanal）地区是全球最大的热带湿地生态系统之一，拥有包括高盐湖在内的复杂水生环境镶嵌体。这些栖息地受季节性洪水、高蒸发率和波动理化参数的影响，形成了高度适应的微生物群落。然而，潘塔纳尔高盐湖的微生物多样性研究仍然不足，阻碍了对该地区新型分类单元和生物活性分子宝贵资源库的全面表征。嗜盐微生物能够产生大量具有生物技术相关性的分子，其中盐单胞菌科（Halomonadaceae）作为最大的嗜盐微生物类群，已知可产生脂质、酶和多糖等多种生物技术相关分子，适用于多种工业过程。在该科中，Vreelandella属是近期从Halomonas属中划分出的五个新属之一，目前包含41个有效发表物种。该属物种呈革兰氏阴性杆菌，具有好氧或兼性厌氧代谢，轻度至中度嗜盐，嗜碱或耐碱，可在pH 5.0–12.0范围内生长。

为扩展巴西潘塔纳尔嗜盐细菌的基因组和功能知识，研究人员对从高盐碱湖中分离的产乳化剂菌株BS253进行了研究。该研究表征了BS253的完整基因组，确定了其在Vreelandella属内的系统发育位置，并整合了表型、生化和功能基因组学分析，以揭示其生态适应性和生物技术潜力。

二、研究内容与主要结论

研究人员采用结合牛津纳米孔长读段和Illumina短读段的混合测序策略，组装了BS253的完整基因组，获得一个3,765,793 bp的环状染色体和两个质粒。通过系统发育和比较基因组学分析，将BS253鉴定为Vreelandella zhaodongensis的一个菌株，ANI值为96.83%，dDDH值为76.4%。基因组挖掘揭示了与耐盐耐碱、烃类和塑料降解以及次级代谢产物生物合成相关的基因。表型上，BS253是一种中度嗜盐、兼性厌氧、革兰氏阴性、非运动性杆菌，在特定培养条件下表现出55.1%的乳化活性（E24）。该研究提供了V. zhaodongensis的首个完整基因组序列，为该物种和该独特嗜盐菌群的研究提供了重要资源，并揭示了BS253作为代谢多样的极端微生物在环境与工业生物技术领域的应用前景。

三、主要关键技术方法

研究人员从巴西潘塔纳尔Nhecolandia地区的高盐碱湖（19°29′26.27″ S, 56°09′32.47″ W）采集沉积物样品，于2017年6月潘塔纳尔"vazante"期（洪水期向旱季过渡期）通过推芯采样获得，采样时湖水盐度为4,710 ppm，pH为10.93。采用混合测序策略，结合Oxford Nanopore长读段和Illumina短读段，使用Trycycler流程进行基因组组装，经Medaka和Polypolish进行一致性校正。基因组注释使用PGAP完成，BUSCO和CheckM评估基因组完整性。系统发育分析采用PhyloPhlAn多标记基因方法结合RAxML和ASTRAL构建物种树，使用fastANI计算ANI，TYGS平台计算dDDH。次级代谢产物基因簇通过antiSMASH注释，烃类和塑料降解基因通过HADEG数据库检索，毒素-抗毒素系统通过TADB数据库注释，抗生素抗性基因通过CARD数据库分析。比较功能基因组学使用OrthoFinder进行直系同源群推断，COG功能分类使用COGclassifier。

四、研究结果

1. 1.
   BS253菌株的表型和生化特征

BS253细胞被鉴定为革兰氏阴性、兼性厌氧、非运动性杆菌。菌落形态随盐浓度略有变化，呈奶油色或米色、圆形、凸起、边缘完整、表面光滑、不透明且外观暗淡。菌落直径随NaCl浓度变化：1% NaCl时为2.3–3.5 mm，5% NaCl时为1.8–2.8 mm，10% NaCl时为0.6–1.2 mm。细胞大小也受盐度影响。BS253被分类为中度嗜盐菌，最适生长NaCl浓度为3–5%，在0%、15%和20% NaCl条件下仅观察到有限生长。生长温度为10–40 °C，最适20–30 °C；pH范围为7–11，最适pH 8。该菌株对尿素、淀粉和Tween 80无水解活性。氧化酶阳性，过氧化氢酶阴性。API 20E和API 20NE生化分析显示，BS253可还原硝酸盐并水解七叶苷，但对硫化氢产生、吲哚产生、Voges–Proskauer反应、ONPG、明胶水解、色氨酸脱氨酶、精氨酸双水解酶、苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶均呈阴性。可从D-葡萄糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、麦芽糖、L-鼠李糖、D-甘露醇、山梨醇和肌醇产生酸，但不发酵乳糖。N-乙酰氨基葡萄糖、麦芽糖和柠檬酸可作为唯一碳源和能源。抗生素敏感性方面，BS253对氨苄青霉素具有抗性，在50和100 μg/mL浓度下72小时后仍观察到细菌生长；对卡那霉素、氯霉素和四环素高度敏感。

1. 2.
   BS253完整基因组特性

BS253基因组通过Illumina和Nanopore测序技术获得，采用混合组装策略产生最终一致性从头基因组组装，大小为3,765,793 bp。完整基因组分布在一个长环状染色体上，G+C含量为53.35%，L90为1，N碱基为0，Illumina覆盖度约529倍，Nanopore覆盖度约267倍。基因组还包含两个质粒，分别为28,749 bp和6,228 bp，基于覆盖度的拷贝数估计表明每个质粒为单拷贝。BS253基因组编码3,417个基因（3,335个CDS和3,288个编码基因）和60个tRNA；rRNA片段包含5S、16S和23S各六拷贝。BUSCO评估显示98.7%的保守直系同源基因完整（单拷贝98.2%，重复0.6%，片段化0.4%，缺失0.9%）。CheckM分析确认高质量组装，完整性99.47%，污染0.46%。COG功能分类显示氨基酸转运和代谢（E）、一般功能（R）、翻译核糖体结构和生物发生（J）、细胞壁/膜/包膜生物发生（M）和转录（K）频率最高。质粒pVBS253_1编码14个CDS，包括五个大型血凝素重复蛋白；质粒pVBS253_2编码八个CDS。基因组中含有小多重耐药（SMR）、抗生素外排泵（qacG）、vanO簇中的vanH基因和耐药结节细胞分裂（RND）抗生素外排泵（rsmA）等抗生素抗性基因类别。

1. 3.
   系统发育分析与进化历史

研究人员采用多标记方法确定菌株BS253与Vreelandella属中已有物种的关系。BS253从头组装基因组与Vreelandella zhaodongensis（taxid=1176240）最佳匹配。BS253与V. zhaodongensis参考基因组（GCF_013415115.1）的ANI值为96.83%，dDDH值为76.4%，支持BS253为V. zhaodongensis的一个菌株。16S rRNA比较显示V. alkaliphila、V. venusta和H. hydrothermalis是与BS253最相似的物种。使用PhyloPhlAn的400个通用标记基因进行系统发育重建，将BS253置于V. zhaodongensis亚支内，与V. alkaliphila、V. venusta和V. andesensis等近缘物种紧密相关，具有强自举支持。

1. 4.
   次级代谢产物与特殊代谢

antiSMASH基因组挖掘在BS253基因组中鉴定了八个推定的生物合成基因簇（BGCs），预测编码多种特殊代谢物类别，包括四氢嘧啶（ectoine）、β-内酯、I型聚酮合酶（T1PKS）、高丝氨酸内酯、含RRE的RiPPs、RiPP样肽、氧化还原辅因子途径和托酚硫代酸（tropodithietic acid）。四氢嘧啶基因簇与已知簇相似度最高，与四氢嘧啶生物合成途径显示75%相似性，该途径通常与嗜盐和耐盐微生物的渗透保护相关。β-内酯簇与霉菌枯草菌素（mycosubtilin）生物合成簇显示20%低相似性。此外还检测到大型T1PKS簇，包含聚酮合酶模块和相关的修饰酶基因。其他预测簇包括高丝氨酸内酯相关区域（可能参与群体感应相关代谢物）、含RRE簇、RiPP样簇（表明可产生核糖体合成和翻译后修饰肽）以及氧化还原辅因子簇（与吡咯喹啉醌（PQQ）生物合成相关）。一个BGC与托酚硫代酸生物合成途径显示55%相似性，该化合物是一种含硫抗菌化合物，常见于海洋细菌。

HADEG分析揭示了与烷烃、芳香族化合物和塑料降解相关的途径。BS253中鉴定出多个与Finnerty途径（ahpC和ahpF）、烃摄取（blc）、儿茶酚降解（pcaF和pcaJ）、龙胆酸降解（nagL）、尿黑酸降解（hmgA）、萘降解（nahF）、苯乙酸降解（paaA、paaB、paaC、paaD和paaK）、原儿茶酸降解（pcaG和pcaH）以及甲苯降解（pobA）相关的基因。此外还检测到可能参与PBAT/PET塑料降解的基因（est）。基因组中还鉴定出23个推定的II型毒素-抗毒素（TA）对，属于多个已充分表征的家族，包括RelE/ParE、VapBC、Phd/YefM、HigBA、HicAB和BrnTA，其中RelE/ParE样系统最为普遍。

乳化活性实验表明，BS253在补充2%葡萄糖的MSM培养基中E24达到55.1%，以石油为底物时E24为56.9%。石油处理与阳性对照之间无显著差异。尽管乳化实验结果为阳性，但液滴坍塌和油扩散实验结果为阴性。

1. 5.
   与近缘物种的比较功能基因组学

将BS253基因组与V. zhaodongensis 9-2T、V. alkaliphila、V. venusta和V. andesensis四个近缘物种进行比较。五个蛋白质组的直系同源群聚类定义了包含4,835个基因家族的泛基因组，其中2,385个为核心基因家族，1,257个为辅助基因家族，1,193个为单基因组特有。BS253贡献了2,426个基因到核心部分，678个到辅助部分，136个菌株特有基因（占其3,240个不同蛋白质的4.2%），是集合中第二小的菌株特有部分。COG功能谱在五个基因组间基本重叠，氨基酸转运和代谢（E）、翻译（J）和细胞壁/膜生物发生（M）是每个基因组中最丰富的类别。BS253与四个近缘物种平均值的最大偏差为防御机制（V；3.6%对2.7%）的富集和碳水化合物转运和代谢（G；5.2%对6.2%）的减少。136个BS253特有蛋白质中，81个无COG分配，55个已分类蛋白质中防御机制（V，n=15）和移动组（X，n=9）合计占44%。染色体上菌株特有基因聚集成35个组，其中最大的是39.0 kb的岛（位置1,822,581–1,861,557），携带完整的整合接合元件（ICE），包含traG、接合转移ATP酶、多个ICE蛋白家族、复制蛋白、ParB分配蛋白、IS200/IS605转座酶和五个II型毒素-抗毒素模块。

对18个降解相关基因的逐一检查显示，其中15个在BS253蛋白质组中被回收，且全部15个在V. zhaodongensis 9-2T中具有互逆最佳命中直系同源基因。其中11个与9-2T对应基因基本一致（95.5–100%氨基酸一致性，中位数99.1%，全长覆盖），与V. alkaliphila、V. venusta和V. andesensis共享80.0–97.9%一致性，唯一缺失的直系同源基因是V. andesensis中的nahF。其余四个基因——苯乙酸环氧酶亚基paaA、paaB、paaC和paaD——显著分化，与9-2T的一致性为46.9–68.3%，而相邻的苯乙酸-CoA连接酶paaK一致性为96.3–96.8%。paaABCD在所有四个近缘物种中的一致分化，加上其他区域近乎一致，与BS253获得一个分化的paaABCD变体一致。

五、讨论与结论

该研究表征了从巴西潘塔纳尔高盐碱湖分离的V. zhaodongensis基因组。Vreelandella属属于Halomonadaceae科，由de la Haba等人于2023年从系统发育异质的Halomonas属分类学再评估中提出。BS253被确认为V. zhaodongensis的一个菌株，ANI为96.83%（高于95–96%物种边界），dDDH为76.4%。目前NCBI基因组数据库中该物种仅有两个已提交的基因组序列，且均为重叠群水平组装。BS253基因组是V. zhaodongensis的首个完整DNA序列，为该物种提供了无间隙、高精度的完整基因组。

BS253的生态起源为其生理适应提供了见解。其近缘系统发育物种来自热带沿海水域、盐池、盐湖和盐碱土壤。与生态环境一致，BS253表现出对盐碱条件的明显偏好，最适NaCl浓度为3–5%，最适pH为8，最适温度20–30 °C，表明其适应盐碱环境。与近缘参考菌株相比，BS253表现出独特的表型特征，包括缺乏运动性、无过氧化氢酶活性和兼性厌氧生长。两个质粒上编码的大型重复蛋白属于TpsA/丝状血凝素家族，其保守N端/可变C端组织以及相邻的小ORF，与多态性毒素盒及其同源免疫伙伴相容。

生化分析进一步支持了BS253的代谢多功能性，其可利用多种碳水化合物产酸并利用多种底物作为唯一碳源和能源，与基因组注释中大量碳水化合物和氨基酸转运代谢相关基因一致。这种代谢灵活性可能有助于BS253在高盐碱湖中的生存，该环境中营养物质、盐度、pH和氧气条件可随季节波动。代谢多功能性延伸至复杂疏水底物的降解，这一过程通常由微生物表面活性剂辅助，与生物修复和强化采油相关。BS253的烃类、芳香族和塑料降解潜力是该进化枝的保守特性而非菌株特有性状，区分BS253与其近缘物种的基因主要与移动遗传元件和抗噬菌体防御相关。

研究结论表明，菌株BS253作为一种中度嗜盐、代谢多样的极端微生物，具有产乳化剂能力和多种生物技术相关代谢途径，是环境与工业生物技术领域有前景的研究候选菌株。