《Antimicrobial Resistance & Infection Control》：Retrospective analysis of the transmission of difficult-to-treat resistant Pseudomonas aeruginosa – genotype beats phenotype
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背景：难治性耐药铜绿假单胞菌（DTRPA）是一种具有挑战性的耐药表型，其中碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌发挥主要作用。然而，碳青霉烯酶阴性DTRPA（CN-DTRPA）对储备抗生素更敏感，且罕见于暴发报道，不同于治疗选择有限且常与暴发相关的碳青霉烯酶产生DTRPA（
背景：难治性耐药铜绿假单胞菌（DTRPA）是一种具有挑战性的耐药表型，其中碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌发挥主要作用。然而，碳青霉烯酶阴性DTRPA（CN-DTRPA）对储备抗生素更敏感，且罕见于暴发报道，不同于治疗选择有限且常与暴发相关的碳青霉烯酶产生DTRPA（CP-DTRPA）。尽管如此，国际指南推荐相同的感染预防与控制（IPC）措施。在此，研究人员利用流行病学和全基因组测序（WGS）分析了CP-DTRPA和CN-DTRPA的传播。方法：对2019年至2024年间收集的临床DTRPA分离株进行WGS。使用核心基因组多位点序列分型（cgMLST）阈值≤11和≤3个等位基因差异定义遗传簇。根据住院时间、患者间接触和环境暴露评估流行病学相关性。对于可能具有流行病学关联的病例，评估碳青霉烯敏感铜绿假单胞菌（CSPA）预定植和住院期间抗生素暴露。结果：在190株DTRPA分离株中，CN-DTRPA（79.5%）占优势，相比20.5%的CP-DTRPA，后者主要携带blaVIM?2。识别出涉及39例患者的12个遗传簇。7个簇（CP-DTRPA n=4；CN-DTRPA n=2，CP-DTRPA/CN-DTRPA混合 n=1）显示可能的流行病学相关性。CP-DTRPA分离株频繁与簇相关（OR 17.47，95% CI 7.43–41.08）和环境传播相关。多样的CN-DTRPA更多与患者间CSPA传播相关，发生在长期抗生素暴露后CN-DTRPA出现之后。结论：CN-DTRPA占优势并显示高度多样性，与预定植患者中可能的抗生素驱动耐药发展一致。相反，较少见且多样性较低的CP-DTRPA与暴发相关。这些发现强调需要评估差异化的IPC策略，包括针对CP-DTRPA的靶向筛查和环境干预，同时进一步研究抗菌药物管理在预防CN-DTRPA出现中的潜在作用。需要多中心研究以形成循证IPC策略。
研究背景：碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌是难治性耐药铜绿假单胞菌（DTRPA）的主要部分；DTRPA定义为对所有标准抗假单胞菌β-内酰胺类、氟喹诺酮类和碳青霉烯类不敏感。抗生素选择压力下，铜绿假单胞菌可经碳青霉烯酶产生及固有机制（如AmpC β-内酰胺酶过表达、外排泵激活和孔蛋白缺失）形成DTRPA。碳青霉烯酶产生DTRPA（CP-DTRPA）常属于国际传播高风险克隆，涉及医院暴发，并常于暴发调查的环境筛查中检出，提示其可在水槽等环境持续和传播；其碳青霉烯酶基因位于可移动遗传元件，利于水平基因转移和克隆扩增。全基因组测序（WGS）研究显示，产碳青霉烯酶与克隆聚集及大型、持续暴发强相关。碳青霉烯酶阴性DTRPA（CN-DTRPA）通常对储备抗生素更敏感，暴发报道较少，发生时规模较小，但来源和传播途径仍不清楚；长期传播链偶可追溯至污染医疗产品。无碳青霉烯酶是否意味着其传播行为类似碳青霉烯敏感铜绿假单胞菌（CSPA），还是仍类似CP-DTRPA，尚不明确。多数国际感染预防与控制（IPC）指南对CP-DTRPA和CN-DTRPA采取相同措施，包括患者隔离和强化环境清洁；仅少部分指南明确区分，并将强化IPC措施限于CP-DTRPA。全球CP-DTRPA高风险克隆广泛存在而指南存在异质性，凸显当前IPC建议不一致。因此，研究人员在六年监测期内结合流行病学数据和WGS分析CP-DTRPA与CN-DTRPA的传播潜力，以评估是否应差异化IPC策略并提供循证依据。
研究方法概述：研究为德国一家三级医院2019年1月至2024年12月回顾性分析；样本队列为常规临床和筛查样本中符合德国卫生当局DTRPA定义的非重复分离株，每例患者纳入首株，排除儿科样本及对亚胺培南和美罗培南表型和基因型均敏感者，最终190株进入分析。关键技术包括NextSeq500平台WGS、SeqSphere+组装、PubMLST序列型（ST）分析、已发表铜绿假单胞菌cgMLST方案聚类（≤11个等位基因差异为簇，≤3为高度相关）、AMRFinderPlus耐药基因检测，并结合住院、患者间接触和环境暴露进行流行病学调查。
研究结果：
分离株特征与遗传多样性：193株非重复DTRPA被测序，3株因核心基因组覆盖不足被排除，190株（98.4%）用于最终分析；CN-DTRPA为151株（79.5%），CP-DTRPA为39株（20.5%）。CP-DTRPA最常见碳青霉烯酶基因为bla
VIM?2（n=23），其次为bla
HMB?1（n=7）、bla
VIM?1（n=6，且bla
HMB?1常与bla
VIM?1双组合，n=5）和bla
NDM?1（n=3）。共鉴定98个ST，包括11个新ST；3株各因一个等位基因缺失无法分配ST，未鉴定ST不属簇且非其他ST的单基因座变异。CP-DTRPA有12个ST，以ST111（n=15）和ST273（n=8）为主，另有5个ST单例；CN-DTRPA有94个ST，以ST244（n=7）、ST446（n=6）和ST395（n=6）较常见，71.3%为单例。CN-DTRPA遗传多样性高于CP-DTRPA，Simpson多样性指数为0.99对0.79。
遗传簇与传播关联：以≤11个等位基因差异为阈值，识别12个簇、涉及39株：5个CP-DTRPA簇（C1、C2、C3、C4、C11）、5个CN-DTRPA簇（C6、C7、C8、C10、C12）和2个混合簇（C5、C9）。CP-DTRPA较CN-DTRPA更可能属于遗传簇（25/39对14/151；Fisher精确检验p<0.001；OR 17.47，95% CI 7.43–41.08）；排除大型ST111簇C1（n=12）后仍稳健（13/27对14/151；OR 9.09，95% CI 3.57–23.12；p<0.0001）。7个簇（C1、C2、C3、C4、C7、C8、C9）存在可能流行病学关联。
具有流行病学关联的簇：C1为ICU暴发，由携带bla
VIM?2的高风险克隆ST111引起，涉及12例患者，但仅6株差异≤3个等位基因且具流行病学关联；环境采样在两个ICU房间的两个水槽中检出bla
VIM?2阳性铜绿假单胞菌，与6例暴发相关患者匹配，提示可能的水槽到患者传播。C2亦为bla
VIM?2阳性ST111，涉及两名相隔两年入住同一病房的患者，分离株仅1个等位基因差异；与C1一株有13个等位基因差异，但无可识别C1流行病学联系，未发现相关环境株。C3为ST273、携带bla
HMB?1/bla
VIM?1的CP-DTRPA簇，含5株，患者无住院重叠，等位基因差异5–9个；所有病例在两个月内发生于两个病房，首例曾入住两病房；非暴发相关时期的环境采样发现2株与C3匹配，其中1株与首例高度相关（≤3个等位基因差异）。C4为ST273、bla
VIM?2阳性簇，2株仅1个等位基因差异，患者相隔两年在同一ICU检出，未发现克隆相关环境株。C7为CN-DTRPA ST446簇，2株仅1个等位基因差异；两患者共住ICU房间7天，期间均未检出DTRPA，但一人携带CSPA，另一人此前无CSPA定植记录；第二例转科后检出CN-DTRPA，两例均在抗假单胞菌药物治疗后、最后接触近两个月后于不同病房发生CN-DTRPA。C8为CN-DTRPA ST377簇，2株2个等位基因差异，患者ICU住院重叠但未同室；第一例因碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌复合群入院隔离，有CSPA定植，住院1个月后首次检出CN-DTRPA；第二例未隔离，入ICU三周后检出CSPA定植，CN-DTRPA在首例死亡近三个月后检出；两例CSPA定植均发生于ICU重叠期，第二例CSPA检出较第一例初始CSPA检出晚9天。C9为ST357簇，涉及相隔三年检出的2例ICU患者，一例为CP-DTRPA（bla
VIM?5），一例为CN-DTRPA，二者8个等位基因差异；CN-DTRPA初筛PCR检出bla
VIM，但WGS未检出；非靶向环境采样发现携带bla
VIM?5的环境株与两临床株匹配。其余C5、C6、C10、C11、C12最多含3株，缺乏明确流行病学联系，分离株间有4–11个等位基因差异。
抗生素暴露：有流行病学关联簇的患者多接受≥4种抗假单胞菌药物。CP-DTRPA簇（n=25）患者平均使用3种不同抗生素、抗生素治疗36.2天；15/25（60.0%）住院期间使用美罗培南，6/25（24.0%）未接受抗生素。CN-DTRPA（n=14）患者平均使用4种不同抗生素、抗生素治疗53.0天；11/14（78.6%）使用美罗培南，1/14（7.1%）未接受抗生素。美罗培南在CN-DTRPA患者中更常用，但差异无统计学意义（Fisher精确检验p=0.30）。
讨论总结：多数国际IPC指南对DTRPA采取相同策略，尽管其耐药机制可能不同。本研究中CP-DTRPA总体较少，但常与传播簇相关，提示较高传播潜力；其遗传多样性较低，ST111和ST273占优势。5个CP-DTRPA簇中4个（C1、C2、C3、C4）可能存在环境到患者传播，部分环境源可经靶向或非靶向采样发现克隆相关分离株。CN-DTRPA多样性高，151株中91个ST，71.3%为单例；5个CN-DTRPA簇中仅C7、C8可能为患者间传播，且两簇患者均有CSPA预定植，提示重叠住院期间以CSPA表型传播，随后在长期抗生素暴露下出现CN-DTRPA。高多样性和单例常见可能提示CN-DTRPA主要经抗生素驱动耐药发展而非克隆传播，而CP-DTRPA主要与患者间传播及持续环境储库相关；但缺乏CN-DTRPA相关环境分离株WGS，该结论仍为假设。水槽是CP-DTRPA全球重要来源，尤其在ICU，可跨病房或长间隔传播，显示环境储库持久。高风险克隆ST111、ST273具全球暴发潜力，本研究还识别ST244和ST357；C5（ST244）和C9（ST357）含CP-DTRPA和CN-DTRPA，其中C9可能因WGS前传代丢失基因解释与产碳青霉烯酶环境株匹配。bla
VIM?2在CP-DTRPA中占优与既往报告一致。数据与既往研究一致：预定植患者抗生素压力是CN-DTRPA耐药发展的关键驱动，而非患者间或环境到患者传播；高达74%耐药铜绿假单胞菌来自先前敏感铜绿假单胞菌定植。既往住院及喹诺酮和碳青霉烯暴露是DTRPA风险因素，但常未区分CP-DTRPA和CN-DTRPA。本队列美罗培南最常用且在CN-DTRPA中更常见，生物学上合理，因为CN-DTRPA耐药机制通常为突变基因和调控，更可能在抗生素选择压力下出现而非水平基因转移；但抗生素尤其美罗培南暴露率无显著差异且仅覆盖39例簇相关患者，137例单例（以CN-DTRPA为主）未调查。患者间传播仅在CSPA定植阶段考虑，CN-DTRPA本身传播不明显。流行病学分析在CN-DTRPA簇中重要；既往亚胺培南耐药铜绿假单胞菌研究中31%分离株遗传相关，结合分子与流行病学后仅11%符合可能传播。因此预防不应仅针对耐药株，而应针对铜绿假单胞菌总体获得，严格标准预防，包括WHO“手卫生五个时刻”、水安全计划和抗菌药物管理（ABS）以减少耐药发展。CN-DTRPA暴发时环境储库应视为合理来源，如挪威全国CN-P. aeruginosa暴发由污染毛巾引起。cgMLST广泛使用但无通用等位基因差异阈值；≤11提出用于一般铜绿假单胞菌，本研究既往暴发报告讨论克隆个体阈值，建议ST111≤3，也适用于非ST111；该阈值适用于5个高度相关簇（C1、C2、C4、C7、C8），均与相应病房流行病学关联；C7和C8重叠病房加强患者间传播证据，但环境源不应忽视。C1（ST111）暴发跨五年，分离株仅≤3个等位基因差异，类似C2和C4的1个等位基因差异但相隔两年，提示低突变株；C3（ST273）暴发两个月内演进并保持≤11个等位基因差异，符合高突变表型；提示暴发定义阈值需差异化解释。但既往研究提示克隆铜绿假单胞菌分离株遗传距离或受影响患者数与暴发时空范围不呈比例。主动筛查DTRPA可能对CP-DTRPA风险因素患者最有效；靶向PCR可快速检测CP-DTRPA，触发环境筛查等IPC措施，最好重复并延长以识别环境储库；早期识别环境储库可靶向干预如无洗手池ICU设计、虹吸管更换和定期消毒，减少环境持续；ABS策略作为CP-DTRPA感染管理支持措施，因报告死亡率增加。局限性包括：质粒可能在实验室过程中丢失，低估碳青霉烯酶流行（如C9混合簇）；常规诊断菌落挑选可能未捕获全部耐药亚群；诊断流程和判读标准变化（如EUCAST 2019重新定义“中介”）可能影响分离株选择和检测敏感性；短读长WGS限制区分克隆传播与无关ST间碳青霉烯酶水平质粒转移；环境采样未覆盖所有病房，仅环境CP-DTRPA测序，限制CN-DTRPA环境获得结论；先前CSPA未测序，不能确定所有CN-DTRPA均来自既有CSPA定植；抗菌选择在CN-DTRPA从CSPA预定植出现中作用仍为假设，抗生素暴露数据仅限簇相关患者且美罗培南暴露无显著差异；单中心，需多中心研究。
研究结论翻译：总之，本研究表明CN-DTRPA构成DTRPA分离株的大多数，并且可能主要通过在既往CSPA定植患者中抗生素驱动的耐药发展而产生，这解释了ST多样性。相反，CP-DTRPA虽然较少见，但与簇和可能的环境传播事件强相关。研究结果质疑当前国际指南对CP-DTRPA和CN-DTRPA同等处理的合理性，更支持差异化IPC策略，即将隔离预防和强化筛查保留给CP-DTRPA。因此，应开展多中心监测研究和环境CN-DTRPA监测，以进一步研究针对CN-DTRPA的隔离预防和常规筛查是否可能不合理且不太可能为预防DTRPA传播提供额外获益。
